Studies on the interactions of proteins with seminal sperm cells and components of thinners used in sperm cryopreservation and molecular markers on the semen parameters in farm animals

A tese à composta por dois capÃtulos. O primeiro capÃtulo inclui o trabalho cujo objetivo foi investigar o potencial uso de pares de transcritos correlativos baseados em microarranjos como marcadores de fertilidade masculina usando a displasia da bainha fibrosa (DFS) como modelo afetado. Atualmente à bastante reconhecido que a tecnologia de microarranjos pode ser limitada pelos custos e que a qualidade dos transcritos permanece relativamente desconhecida. Para responder essas questÃes, nÃs analizamos pares de transcritos estÃveis por qPCR com um processo sistemÃtico de desenho de primers sistemÃtico. Nesse estudo experimental, nÃs utilizamos amostras de homens com fertilidade comprovada e de homens com diagnÃtico de DFS. Nossa abordagem foi baseada nas sequÃncias de primers dos seis genes de interesse, os quais foram desenhados utilizando os programas Oligo7 e Primer3Plus. A especificidade do primer foi inicialmente analisada in silico atravÃs de pesquisas nos bancos de dados ENSEMBL, University of California Santa Cruz (UCSC), e National Center for Biotechnology Information (NCBI) para uso de sequÃncias especÃficas aos genes alvos. A habilidade dos pares de transcritos em classificar as amostras de homens de fertilidade comprovada das amostras de DFS foi avaliada. Nossos resultados mostraram que em conjunÃÃo com a identificaÃÃo de quatro novos pares estÃveis, a comparaÃÃo dos coeficientes de correlaÃÃo dos valores de C(t) dos DSF revelou a interrupÃÃo de quatro pares estÃveis identificados nas amostras de homens normais. Esta seleÃÃo de pares estÃveis resolve a questÃo sobre a DSF. Em conclusÃo, os resultados mostram efetivamente que o desenho de primers e qPCR podem fornecer um ensaio molecular de baixo custo para avaliar a fertilidade masculina. O segundo capÃtulo divide-se em dois estudos e avalia em carneiros os efeitos de uma dieta suplementada com farelo de castanha de caju. No estudo 1, nosso objetivo foi detectar a presenÃa de transcritos para Heat Shock Protein (HSP70), clusterina (CLU), proteÃna semelhante à subunidade alfa do complexo T (TCP1) e proteÃna do complexo T subunidade 8 (CCT8) no espermatozÃide de ovinos, seguindo a mesma metodologia para qPCR utilizada no capitulo 1. As sequÃncias de primers foram desenhadas utilizando os programas Primer3Plus e Oligo Analyzer. Gene para protamina 2 (PRM2) foi usado como controle interno de reaÃÃo. O sÃmen foi coletado de machos pÃberes Morada Nova utlizando eletroejaculador. As amostras selecionadas para extraÃÃo de RNA espermÃtico seguiram as recomendaÃÃes do ColÃgio Brasileiro de ReproduÃÃo Animal quanto aos parÃmetros de motilidade, vigor e concentraÃÃo. Nossos resultados mostraram a presenÃa de mRNA para a HSP70 nos espermatozÃides de ovinos. Maiores estudos sÃo necessÃrios a fim de confirmar ou refutar a presenÃa das chaperonas TCP1 e CCT8 no espermatozÃide ovino. A presenÃa do transcrito da HSP70 no espermatozÃide de ovinos abre perspectivas para estudos futuros sobre os efeitos do mRNA HSP70 no desenvolvimento embrionÃrio, de modo a avaliar se essa expressÃo ocorre de modo espontÃneo, programado e seqÃencial, e se esses mecanismos se refletem na fertilidade e no desenvolvimento embrionÃrio. O segundo estudo tem como principal objetivo avaliar os efeitos de uma dieta contendo farelo de castanha de caju (FCC) na expressÃo de genes relacionados ao metabolismo dos lipÃdios no mÃsculo Longissimus dorsi de carneiros Morada Nova. Vinte carneiros maduros sexualmente foram divididos em dois grupos baseando-se no peso vivo. Os animais foram mantidos em baias individuais. Durante trÃs meses, o grupo castanha (GCA) foi alimentado com raÃÃo contendo FCC, enquanto o grupo controle (GCO) recebeu raÃÃo à base de milho e soja. As duas dietas eram isocalÃricas e isoprotÃicas, adicionadas de suplemento mineral. Os carneiros tambÃm receberam feno de Tifton e Ãgua à vontade. A quantidade de alimento ofertado (raÃÃo e feno) foi ajustada diariamente para sobra de 10%. Sete genes codificantes de proteÃnas envolvidas direta ou indiretamente foram selecionados como alvos, incluindo: GH, ACACA, CAST, CAPN3, LPL, SCD e FASN. Para normalizaÃÃo, foram selecionados cinco genes candidatos: ACTB, GAPDH, RPL4, RPS18 e TBP. Dentre os sete genes alvos selecionados anteriormente, os alvos GH, ACACA e CAST foram removidos. Os dois primeiros foram removidos devido amplificaÃÃo de alinhamento mÃltiplo (baixa especificidade do primers), enquanto CAST apresentou baixa eficiÃncia de amplificaÃÃo. Da lista de gene alvo final, a expressÃo de somente dois genes foi afetada pela dieta, SCD (p<0.01) e FASN (p<0.05), enquanto LPL (p=0,1022) e CAPN3 (p=0,0939) nÃo apresentaram diferenÃa significativa (p<0.05). Os genes SCD e FASN foram reprimidos no GCA comparada ao GCO. Este à o primeiro relato de que uma raÃÃo contendo FCC afetou a expressÃo gÃnica de proteÃnas envolvidas na deposiÃÃo de lipÃdios no mÃsculo em ovinos. Considerando que uma dieta contendo FCC altera a expressÃo de genes lipogÃnicos sem afetar o ganho de peso nem a eficiÃncia reprodutiva de ovinos, faz da castanha de caju uma importante alternativa para o sistema de produÃÃo de ovinos criados em regiÃes tropicais.This thesis presents two chapters. In the first chapter, its objective was to investigate the potential use of correlative microarray-based transcript pairs as candidate markers for male fertility using dysplasia of the fibrous sheath (DFS) as an affected model. It is widely recognized that microarray technology may be limited by cost and that the quality of the transcript remains relatively unknown. To address these issues, we analyzed the stable transcript pairs by qPCR with a systematic primer design process. On this experimental study, we used men with proven fertility and men with a diagnosis of DFS. Our approach was based on primer sequences for six genes of interest were designed using Oligo7 and Primer3Plus. Primer specificity was initially assessed in silico by searching the ENSEMBL, University of California Santa Cruz, and National Center for Biotechnology Information databases for nontarget complementary sequences throughout the genome. The ability of transcript pairs to classify samples from males of proven fertility away from DFS was assessed. Our results showed that in conjunction with identifying four new stable transcript pairs, comparison of the DFS qPCR C(t) correlation coefficients revealed the disruption of four stable fertile sample transcript pairs. This suite of transcript pairs resolves DFS. In conclusion, the results show that with effectively designed primers, qPCR may provide an affordable molecular assay to assess male fertility status. Second chapter includes two studies regarding evaluations of ram feeded with supplemented diet with cashew nut. On the frist study, our goal was detect transcripts for Heat Shock Protein (HSP70), Clusterin (CLU), Ovis aries T-complex protein 1 alfa subunit-like protein (TCP1) e Ovis aries chaperonin containing TCP1, subunit 8 (theta) (CCT8) on ram sperm by. For primer designing we used published ESTs from NCBI and manually annotated by us using Primer3Plus and OligoAnalizer. PRM2 was used as internal qPCR control. Semen samples from mature Morada Nova ram were collected by eletroejaculator, washed in PBS and prepared for further RNA extraction. Selected samples followed quality recommendatios from ColÃgio Brasileiro de ReproduÃÃo Animal regarding motility, vigor and concentration. Our results showed presence of mRNA HSP70 on ram sperm and they can possible be envolved in early embryo development, oocyte activation and post fertilization events. Further analyses will be necessary to confirm presence of TCP1 and CCT8 on ram sperm. Our findings indicate new perpectives about the effects of these chaperones during embryo development mesuring if its expression reflects male fertility on the early embryo development. On the second study the the main goal is to evaluate the effects of a lipid-enriched diet containing cashew nut brain on the expression of genes related to lipid metabolism in the longissimus dorsi muscle of Morada Nova rams. Twenty sexually mature and reproductively sound rams were divided in two groups based on ram live weight, and each ram was kept on individual pens. During three months, group 1 (G1) rams were fed with a lipid-rich diet, containing cashew nut bran (CNB), while group 2 (G2) was fed with a meal based on corn and soy. Both diets were isocaloric and isoproteic, and had a mineral mix added-in. The rams also were offered Tifton grass hay and had free access to water. The amount of diet offered (ration plus hay) was adjusted everyday to a maximum waste of 10%. Seven genes coding for proteins directly or indirectly involved in lipid metabolism were initially selected as targets, incluiding GH, ACACA, CAST, CAPN3, LPL, SCD, and FASN. Also, five genes were selected as reference genes, ACTB, GAPDH, RPL4, RPS18 and TBP. From the seven genes originally selected as targets, GH, ACACA and CAST were removed, leaving the final list with four targets. The first two genes were removed due to alternative pairing of the primers (low specificity), while CAST showed low amplification efficiency during PCR reaction. From the final target list, the expression of only two genes was affected by diet, SCD (p<0.01) and FASN (p<0.05), while LPL (p=0,1022) and CAPN3 (p=0,0939) were not different at the p