Structural aspects of the vasorelaxant effect of legume lectins

As lectinas sÃo proteÃnas multiativas que apresentam pelo menos um sÃtio capaz de reconhecer de maneira reversÃvel carboidratos especÃficos sem modificÃ-los. A famÃlia das lectinas de leguminosas representa o grupo desta classe proteica mais bem estudada, em especial destaque a subtribo Diocleinae. As lectinas de Diocleinae apresentam um alto grau de similaridade estrutural, porÃm o mesmo nÃo se observa quanto Ãs atividades biolÃgicas. Esta variabilidade reside em detalhes que podem ser analisados em estudos baseados em estruturas. A sequÃncia primÃria da lectina de C. grandiflora (ConGF) apresenta grande similaridade com lectinas do mesmo gÃnero, porÃm concentra o maior nÃmero de mutaÃÃes representativas do gÃnero Dioclea, caracterizando-o como o subgÃnero de Canavalia mais prÃximo de Dioclea, e dentre as canavalias à a mais primitiva. A ConGF apresentou efeito relaxante em mÃsculo liso de aortas de ratos endotelizadas, no entanto, os efeitos mostram-se fracos frente a outras lectinas de Diocleinae. A justificativa para este fato nÃo reside em uma baixa similaridade estrutural, mas em pequenas mudanÃas na orientaÃÃo de aminoÃcidos-chave, que se tornam responsÃveis pela diversidade na aÃÃo biolÃgica apresentada aqui, como deve ocorrer em outros fenÃmenos elicitados por lectinas. Para a lectina de Cymbosema roseum (CRLI), alÃm de avaliado o efeito relaxante, foi observado o papel do cÃlcio extracelular nesta atividade. Surpreendentemente, o cÃlcio nÃo foi definitivo para determinar o mecanismo de CRLI como dependente ou independente deste Ãon. Nossa investigaÃÃo permitiu a formulaÃÃo de uma hipÃtese em que esta lectina apresenta um duplo mecanismo de ativaÃÃo da Ãxido nÃtrico sintetase endotelial (eNOS). A primeira via à baseada em um receptor especÃfico na membrana do endotÃlio capaz de ativar a eNOS atravÃs da calmodulina. A segunda via à baseada na habilidade de ligaÃÃo de CRLI ao heparano sulfato do glicocÃlice em um sÃtio diferente do CRD demonstrada por docking molecular, o que justifica a ativaÃÃo mecÃnica da eNOS. Este proteoglicano à o principal candidato a mecanoreceptor da tensÃo de cisalhamento, principal fenÃmeno da manutenÃÃo do tÃnus vascular pela produÃÃo de NO. Dentre as proteÃnas de Diocleinae, foi ainda avaliada uma lectina do gÃnero Dioclea. D. sclerocarpa apresentou, como as outras lectinas deste trabalho, a habilidade de relaxar mÃsculos lisos de aortas. FenÃmeno que ocorreu com a dependÃncia do endotÃlio via produÃÃo de Ãxido nÃtrico e com a participaÃÃo do CRD de DSL. Tanto seu efeito como sua estrutura apresentam alto grau de semelhanÃa com lectinas do mesmo gÃnero e um conjuntos de caracterÃsticas corrobora para seu baixo efeito relaxante. DSL apresenta um desenho de CRD pouco favorÃvel para esta atividade e, alÃm disso, a presenÃa de um glutamato na posiÃÃo 205 demonstrou ser um fator determinante na regulaÃÃo desta atividade. Este resÃduo modula negativamente a capacidade relaxante frente a lectinas que do mesmo gÃnero que possuem um resÃduo de aspartato nesta mesma posiÃÃo.Lectins are multiactive proteins that have at least one domain capable of recognizing specific carbohydrates reversibly without changing them. The legume lectin family is a group of this protein class further studied, in particular highlighted the subtribe Diocleinae. These lectins have a high degree of structural similarity, but it does not follow the biological activities. This variability must reside in details, small differences that can be analyzed in studies based in structures. The primary sequence of C. grandiflora lectin (ConGF) shows great similarity with lectins of the same genus, but it has the largest number of mutations representative of the genus Dioclea, characterizing it as the Canavalia subgenus closest to Dioclea, and it is the most primitive among the canavalias. ConGF presented relaxing effect on smooth muscles of endothelial aortas of rats; however, the effects are weak against other Diocleinae lectins. The justification for this does not lie in a low structural similarity but in small changes in the orientation of key amino acids residues, which become responsible for biological diversity in action presented here, as required in other phenomena elicited by lectins. For Cymbosema roseum lectin (CRLI), the relaxing effect was also evaluated and the role of extracellular calcium was observed for this activity. Surprisingly, the calcium was not definitive for determining CRLI mechanism as dependent or independent of calcium ions. Our research has led to the construction of a theory which this lectin has dual mechanism of nitric oxide synthase (eNOS) activation. The first path is based on a specific membrane endothelial receptor able to activate eNOS by calmodulin. The second path relies on the ability of CRLI binding to the glycocalyx heparano sulfate at a domain different from the CRD demonstrated by molecular docking, which explain mechanical activation of eNOS. This proteoglycan is the main mechanoreceptor candidate of shear stress and this phenomenon is the major agent of maintenance of vascular tone by NO production. A lectin from gender Dioclea was also evaluated to increase the range of legume proteins tested. As other lectins of this work, D. sclerocarpa presented the ability to relax smooth muscle of the aorta dependent on the endothelium nitric oxide production. Both its effect and its structure have a high degree of similarity with lectins of the same genus. A feature set corroborates with its low relaxant effect. DSL has a CRD design less favorable for this activity. In addition, the presence of a glutamate at position 205 proved to be a decisive factor in the activity regulation and it negatively modulates Dioclea lectins relaxant effect