study of detention of lipase from rhizomucor miehei organo in-gel for use in organic synthesis

Lipases, triacilglicerol Ãster hidrolases E.C. 3.1.1.3, sÃo enziÂmas que atuam nas ligaÃÃes Ãsteres de triacilglicerÃis, liberando Ãcidos orgÃnicos e glicerol. Podendo, em condiÃÃes microaquosas, catalisar a reaÃÃo reversa. Uma limitaÃÃo da utilizaÃÃo destas enzimas em processos industriais reside na falta de estabilidade operacional e na impossibilidade de sua reutilizaÃÃo na forma livre. O uso do sistema de organo-gÃis consiste em uma alternativa para a imobilizaÃÃo de enzimas, e para sua utilizaÃÃo na catÃlise enzimÃtica em meio orgÃnico. Neste sistema a enzima està localizada no centro micelar (centro aquoso) do organo-gel, eliminando o problemas como de estabilizar a enzima contra inativaÃÃo por um solvente nÃo-aquoso. O objetivo deste trabalho foi desenvolver derivados de lipases de Rhizomucor miehei imobilizadas em organo-gÃis à base de polÃmeros, visando à sÃntese de Ãsteres etÃlicos a partir de reaÃÃes de esterificaÃÃo de matÃrias-primas com elevado teor de Ãcidos graxos livres. Os suportes foram obtidos atravÃs de diferentes combinaÃÃes entre os componentes. Utilizaram-se polÃmeros gelatina (Gel), alginato (Alg) ou quitosana (Qui), fases orgÃnicas hexano (Hex) ou heptano (Hep) e os tensoativos dodecilsulfato de sÃdio (SDS) ou brometo de acetilmetilamÃnio (CTABr). Verificou-se a estabilidade tÃrmica da enzima na sua forma livre, determinando seu tempo de meia-vida. Na primeira etapa, foram produzidos derivados com e sem ativaÃÃo via glutaraldeÃdo 2% (v/v). A atividade enzimÃtica foi avaliada atravÃs hidrÃlise do p-nitrofenilbutirato (pNPB). Os derivados foram caracterizados quanto: fator de estabilidade a 60ÂC em relaÃÃo à enzima livre, eficiÃncia e rendimento de imobilizaÃÃo para assim determinar os melhores biocatalisadores. Dentre os catalisadores obtidos, os melhores apresentaram eficiÃncia de 4,1% e fator de estabilidade 30 vezes (Gel/SDS/Hex), eficiÃncia de 6,0% e fator de estabilidade 1,3 vezes (Alg/SDS/Hep) e eficiÃncia de 1,0% e fator de estabilidade de 2,3 vezes (Qui/SDS/Hep). Os suportes produzidos ativados com glutaraldeÃdo 2% (v/v) apresentaram baixas atividades e eficiÃncias, apesar de obterem valores bons de tempo de meia-vida e fator de estabilidade. Os derivados produzidos com o tensoativo CTABr apresentaram baixas atividades, eficiÃncias, tempo de meia-vida e fator de estabilidade. Na segunda fase, os derivados selecionados foram estudados quanto à carga mÃxima (50 U.g-1 a 500 U.g-1) de imobilizaÃÃo e eficiÃncia, nas temperaturas de 15ÂC e 25ÂC. Avaliou-se a aplicaÃÃo dos biocatalisadores na reaÃÃo de esterificaÃÃo do oleato de etila a partir de Ãcido oleico e etanol, variando a razÃo molar Ãcido/Ãlcool e utilizaÃÃo de agente dessecante (zeÃlitas). Verificou-se a estabilidade de estocagem sob 10ÂC por um perÃodo de 100 dias. Todos os derivados apresentaram melhores eficiÃncias utilizando carga de 50 U.g-1, apresentando valores de 4,2% e 4,8% (Gel/SDS/Hex), 2,0% e 2,3% (Alg/SDS/Hep) e 0,9% e 1,1% (Qui/SDS/Hep ) nas temperaturas de 15ÂC e 25ÂC, respectivamente. Nas reaÃÃes de esterificaÃÃo os derivados Gel/SDS/Hex e Alg/SDS/Hep obtiveram maiores conversÃes na razÃo molar Ãcido/Ãlcool 1:10, 72,9% e 16,9%, respectivamente. O derivado Qui/SDS/Hep obteve 80,0% de conversÃo na razÃo de 1:1. Com utilizaÃÃo de zeÃlitas o derivado Gel/SDS/Hex aumentou a conversÃo para 79,0% nas razÃes 1:1 e 1:5, os derivados Alg/SDS/Hep e Qui/SDS/Hep apresentaram decrÃscimo nas conversÃes. Durante os 100 dias de estocagem sob 10ÂC, os derivados Gel/SDS/Hex e Qui/SDS/Hep mantiveram atividade hidrolÃtica atà 40 dias, tendo um decrÃscimo ao longo do tempo. O derivado Alg/SDS/Hep obteve um tempo maior de 60 dias, apresentando tambÃm um decrÃscimo.Lipases, triacylglycerol ester hydrolases EC 3.1.1.3, are enzymes that act on ester bonds of triacylglycerols, releasing organic acids and glycerol. May in microaquosas conditions, catalyze the reverse reaction. A limitation of using these enzymes in industrial processes is the lack of operational stability and the inability to re-use the free form. The use of organo-gels system is an alternative for the immobilization of enzymes and to their use in enzyme catalysis in organic media. In this system the enzyme is located in the micelle center (aqueous center) of the organo-gel, eliminating problems such as stabilizing the enzyme against inactivation by a non-aqueous solvent. The aim of this work was immobilize lipases from Rhizomucor miehei into organo - gels based on polymers for future application in ethyl esters synthesis through esterification of raw materials with high free fatty acids content. Supports were obtained using different combinations of components. It was used gelatin polymers (Gel), alginate (Alg) and / or chitosan (Chi), organic phases such as hexane (Hex) and heptane (Hep) and surfactants sodium dodecyl sulfate (SDS) or acetylmetylamonium bromide (CTABr). In the first step, derivatives were produced with and without glutaraldehyde 2% (v/v) activation. Enzymatic activity was measured by hydrolysis of p â nitrophenyl butyrate (PNPb). Biocatalysts were characterized as: stability at 60  C and compared to free enzyme, immobilization efficiency and yield factor, thus determining the best biocatalysts. Among the catalysts obtained, (Gel/SDS/Hex) showed the best efficiency of 4.1% , 30 âfold more stable; (Alg/SDS/Hep) with 6.0% efficiency , 1.3 âfold more stable and (Qui/SDS/Hep) with efficiency of 1.0 % , 1.3 âfold more stable than free lipase. Obtained supports activated with glutaraldehyde 2 % (v/v) showed lower activities and efficiencies, in despite of having good values for stability factor. Produced derivatives using surfactant CTABr presented low activity, efficiency and stability factor. In the second step, derivatives were analyzed as maximum load (50 U.g-1 a 500 U.g-1) enzyme immobilization and efficiency at 15  C and 25  C. It was evaluated biocatalysts application in ethyl oleate achievement in an esterification reaction, using oleic acid and ethanol, by varying molar ratio acid / alcohol with and without using of desiccant agent (zeolite) at 37  C and 24 h of reaction. Derivatives were submitted storage stability under 10  C studies, for a period of 100 days. All derivatives showed higher efficiencies using an initial enzyme loading of 50 U.g -1, with values of 4.2% and 4.8% (Gel/SDS/Hex), 2.0 % and 2.3 % (Alg/SDS/ Hep) and 0.9 % to 1.1% (Qui/SDS/Hep) at 15  C and 25  C, respectively. In esterification reactions, Gel/SDS/Hex and Alg/SDS/Hep derivatives showed higher conversions 72.9 % and 16.9 %, respectively, with molar acid / alcohol 1:10. The chemical derivative Qui/SDS/Hep presented 80.0 % conversion with molar acid / alcohol 1:1 ratio. Using zeolites, Gel/SDS/Hex conversion increased to 79.0 % using ratios of 1:1 and 1:5, the Alg/SDS/Hep and Qui/SDS/Hep presented a decreasing in conversions. During 100 days of storage at 10  C, Gel/SDS/Hex and Qui/SDS/Hep hydrolytic activity maintained up to 40 days and a decreasing during this period, however, Alg/SDS/ Hep achieved more than 60 days with activity