Production of β-galactosidase from Kluyveromyces lactis NRRL Y1564 in whey and immobilization in chitosan.

Neste trabalho, a enzima β-galactosidase, que catalisa a hidrÃlise da lactose em glicose e galactose, foi produzida pelo cultivo do micro-organismo Kluyveromyces lactis NRRL Y1564 em soro de leite suplementado com extrato de levedura. A enzima à um metabÃlito intracelular, sendo a liberaÃÃo da enzima para o meio uma condiÃÃo essencial, por isso estudaram-se diferentes mÃtodos quÃmicos e mecÃnicos de extraÃÃo como, agitaÃÃo com pÃrolas de vidro, ruptura em ultrassom com pÃrolas de vidro, adiÃÃo de etanol e tolueno, observando tambÃm, seus efeitos na atividade enzimÃtica. Posteriormente, realizaram-se ensaios para estudar a influÃncia da temperatura (30, 34, 37 e 40 ÂC) na produÃÃo da enzima a partir do soro de queijo. Na extraÃÃo da enzima, o uso de esferas de vidro em vÃrtex foi o mÃtodo mais eficiente quando comparado com os outros avaliados. A enzima, nÃo sofreu inibiÃÃo ou desnaturaÃÃo quando incubadas com etanol, tolueno ou etanol-tolueno. A temperatura Ãtima de produÃÃo da enzima por K. lactis NRRL Y1564 foi 30 ÂC, com atividade enzimÃtica de 4418,37 U/g de cÃlulas em 12 h de fermentaÃÃo. A enzima produzida foi imobilizada em quitosana 2,0% m/v. Diferentes protocolos de ativaÃÃo usando glutaraldeÃdo, epicloridrina ou glicidol foram avaliados. Estudou-se tambÃm, o tempo de contato enzima-suporte (3, 5 e 10 horas) a fim de se obter um biocatalisador que apresentasse alto rendimento, atividade recuperada e tempo de meia-vida, visando a hidrÃlise da lactose em reator batelada e leito fixo. A influÃncia da temperatura e do pH na hidrÃlise da lactose foi avaliada, usando como substrato uma soluÃÃo sintÃtica (lactose 5,0% (m/v) e leite desnatado, contendo 4,3% m/v de lactose. O suporte que apresentou melhores resultados nos parÃmetros de imobilizaÃÃo foi a quitosana 2% reticulada com glutaraldeÃdo no tempo de imobilizaÃÃo de 5 horas. O biocatalisador produzido nesse estudo apresentou um fator de estabilidade de 17,37 vezes maior que a enzima solÃvel, com uma estabilidade de armazenamento de 100% quando armazenada a 4 ÂC por 90 dias. A temperatura Ãtima de hidrÃlise da lactose foi de 40 ÂC e o pH Ãtimo foi 7,0 . A conversÃo da lactose a 40 ÂC para este derivado (3,0 U/g) foi em mÃdia 53% em 10 ciclos (bateladas consecutivas). Em reator batelada, a conversÃo em glicose a partir da hidrÃlise da lactose, usando soluÃÃo sintÃtica, foi aproximadamente 86 % para a enzima solÃvel (3,8 U/mL) e 83 % para a enzima imobilizada (3,8 U/g). A conversÃo obtida na hidrÃlise do leite desnatado foi de 17 % para a enzima solÃvel e 20 % para a enzima imobilizada.In this work, the enzyme β-galactosidase which catalyzes the hydrolysis of lactose to glucose and galactose, was produced by cultivating the micro-organism Kluyveromyces lactis NRRL Y1564 in whey supplemented with yeast extract. The enzyme is an intracellular metabolite, the release enzyme is very important, therefore were studied various chemical and mechanical methods of extraction and stirring with glass beads, sonication, addition of ethanol and toluene, noting also their effects on enzymatic activity. Subsequently, trials were carried out to study the influence of temperature (30, 34, 37 and 40  C) in the production of the enzyme from the cheese whey. In the enzyme extraction, using glass beads by a vÃrtex was more efficient method compared to others evaluated. The enzyme not presented inhibited or denatured when incubated with ethanol, toluene or ethanol-toluene. The optimum temperature for enzyme production by K. lactis NRRL Y1564 was 30 ÂC with enzymatic activity of 4418.37 U/g of cells at 12 h of fermentation. The enzyme produced was immobilized on chitosan 2.0% w/v. Different activation protocols using glutaraldehyde, epichlorohydrin or glycidol were evaluated. Was also studied, the contact time the enzyme-carrier (3, 5, and 10 hours) to obtain a biocatalyst to produce high yield, recovered activity and half-life in order to hydrolysis of lactose in batch reactor and fixed bed. The influence of temperature and pH on the hydrolysis of lactose was evaluated using as substrate a synthetic solution (lactose 5.0% (w/v) in potassium phosphate buffer 100 mM with 0.1 mM MnCl2) and skimmed milk containing 4.3% w/v lactose. The support shows better results in the parameters of immobilization was chitosan 2% actived with glutaraldehyde and contact time of 5 hours. The biocatalyst produced in this study showed a stability factor of 17.37 and a storage stability of 100% when stored at 4 ÂC for 90 days. Temperature optimum hydrolysis of lactose was 40 ÂC and the optimal pH 7.0. The conversion of lactose to 40 ÂC for this derivative (3.0 U/g) was on average 53% in 10 cycles (consecutive batches). In batch reactor, the conversion to glucose by the hydrolysis of lactose using synthetic solution was approximately 86% for the soluble enzyme (3.8 U/mL) and 83% of the immobilized enzyme (3.8 U/g). The conversion obtained in the hydrolysis of skim milk was 17% for the soluble enzyme and 20% for the immobilized enzyme