CaracterizaÃÃo bioquÃmica, funcional e estrutural de duas cistatinas recombinantes de feijÃo-caupi.

mRNA sequences coding for two cystatins were isolated from leaves of hydroponically growing cowpea plants. The sequences were ligated in the expression vector pET302NT-HIS, which was introduced into Escherichia coli, ArcticExpress (DE3) cells. The expression was induced by addition of 0.5 mM IPTG and the recombinant proteins VuCys1 (Vigna unguiculata one-domain cystatin) and VuCys2 (Vigna unguiculata two-domain cystatin), both fused to an N-terminal 6x-His tag, were purified by homogeneity using an affinity matrix containing Ni2+ immobilized to Sepharose. The apparent molecular masses for VuCys1 (yield of 10 mgP.L-1 culture) and VuCys2 (yield of 22 mgP.mL-1 culture) were 14 and 26 kDa, respectively. Both inhibitors were strongly active against the proteinases papain and chymopapain, while bromelain and particularly cathepsin B were less susceptible to in vitro inhibition. No inhibition was detected against the serine proteinase trypsin. Thermal stability tests revealed that both cystatins are thermostable proteins able to achieve a minimum residual proteolytic inhibition activity against papain of 95% (VuCys1) and 85% (VuCys2) when incubated at 100 C for 60 minutes. Similar stability results were also obtained when the proteins were tested to the ability of to inhibit papain activity after incubation in pH values ranging from 2.0 to 11.0. Circular dichroism spectroscopy measurements demonstrated that the secondary structure arrangement of both cystatins undergoes only fewer alterations when both proteins were incubated in temperatures varying from 10 to 90 C and pH values varying from 2.0 to 11.0, as well. These data are in agreement with the thermal and pH stability results previously obtained on papain inhibition assays. Biological assays conducted with different phytopathogenic fungi didnât show any negative impact on spore germination as well as on mycelial growth of the tested fungi. Different human pathogens, including the pathogenic yeast Candida albicans were shown to be insensible to VuCys1 and VuCys2. Some scientific reports have proposed the use of cystatins as potential molecules in the control and inhibition of the activity of cysteine proteinases related to carcinogenic process. However, cytotoxicity assays performed on three tumor cell lineages revealed no toxic effects of VuCys1 and VuCys2. Inhibitor activities were also tested against digestive enzymes isolated from third instar larvae of the bruchid insects Callosobruchus maculatus and Zabrotes subfasciatus, two major cowpea plagues. Both cystatins were able to cause high inhibition of C. maculatus enzymes; however they were poorly active against Z. subfasciatus counterpart. Feeding tests were conducted in which both cystatins were added to artificial seeds at final concentrations of 0.025, 0.05 and 0.1% and supplied to C. maculatus. Despite the in vitro inhibition of C. maculatus larvae enzymes, the bioassay data suggest that larvae and adult insects appear to develop adaptive mechanisms which can make them insensible to the ingestion of the inhibitors. Crystallographic studies were carried out in order to solve the tridimensional structure of cystatins. 576 different crystallization conditions were tested in which three were favorable to the formation and growth of diffractable crystals of VuCys1 protein. These crystals belong to the orthorhombic space group P212121 and the unit cell dimension was a = 41.48 Ã; b = 64.68 à and c = 87.91 Ã, α = β = γ = 90. V. unguiculata one-domain cystatin presents a typical 3D domain swapped dimmer molecular structure, which was solved at 1.95 à resolution. No crystals were obtained for VuCys2. The physiological importance of this structure to the plant, the structural stability of both inhibitors and the results raised from biological assays are all discussed in this work.SequÃncias de mRNA que codificam para duas cistatinas foram isoladas de folhas de plantas de feijÃo-caupi cultivadas em sistema hidropÃnico. As sequÃncias foram ligadas no vetor de expressÃo pET302NT-His, o qual foi introduzido em cÃlulas de Escherichia coli, ArcticExpress (DE3). A induÃÃo da expressÃo foi realizada por meio de adiÃÃo de IPTG (0,5 mM) e as proteÃnas recombinantes VuCys1 â (cistatina de um domÃnio de Vigna unguiculata) e VuCys2 â (cistatina de dois domÃnios de V. unguiculata) ambas fusionadas a uma cauda de histidina N-terminal, foram purificadas por homogeneidade em matriz de afinidade constituÃda de Ni2+ imobilizado à Sepharose. VuCys1 apresentou uma massa molecular aparente de 14 kDa e um rendimento de 10 mgP.L-1 de meio de cultura, jà a proteÃna VuCys2 mostrou uma massa molecular aparente de 26 kDa e um rendimento de 22 mgP.L-1 de meio de cultura. As duas proteÃnas foram fortemente ativas contra as proteinases papaÃna e quimopapaÃna, moderadamente ativas contra bromelaÃna e apenas fracamente ativas contra catepsina B, enquanto que nenhuma atividade inibitÃria foi detectada contra a proteinase serÃnica tripsina. Ensaios de estabilidade tÃrmica mostraram que as duas cistatinas sÃo proteÃnas termoestÃveis, uma vez que, mesmo apÃs incubaÃÃo a 100 C por 60 minutos apresentam atividade inibitÃria residual contra papaÃna superior a 95% (VuCys1) e superior a 85% (VuCys2). Resultados similares de estabilidade tambÃm foram obtidos quando as proteÃnas foram testadas quanto à capacidade de inibir a atividade de papaÃna, apÃs incubaÃÃo em valores de pH variando de 2,0 a 11,0. AnÃlises espectroscÃpicas de dicroÃsmo circular revelaram que o padrÃo de estruturas secundÃrias de ambos inibidores sofre pouca alteraÃÃo apÃs incubaÃÃo em temperaturas variando de 10 a 90 C e em valores de pH variando de 2,0 a 11,0. Estes dados estÃo de acordo com os resultados de elevada estabilidade tÃrmica e a extremos de pH previamente obtidos nos ensaios de inibiÃÃo in vitro de papaÃna. Ensaios biolÃgicos realizados com diferentes espÃcies de fungos fitopatogÃnicos nÃo mostraram nenhum efeito negativo das proteÃnas sobre a germinaÃÃo de esporos ou crescimento micelial dos fungos testados. Os inibidores tambÃm nÃo se mostraram ativos contra diferentes patÃgenos humanos, incluindo a levedura patogÃnica Candida albicans. Alguns relatos cientÃficos propÃem o uso de cistatinas como agentes em potencial no controle e inibiÃÃo da atividade de proteinases cisteÃnicas relacionados a processos carcinogÃnicos. Contudo, testes de citotoxicidade dos inibidores para trÃs diferentes linhagens de cÃlulas tumorais nÃo mostraram potencial citotÃxico. Os inibidores tambÃm foram testados quanto à capacidade de inibir a atividade de enzimas digestivas isoladas do intestino de larvas de terceiro instar dos insetos bruquÃdeos Callosobruchus maculatus e Zabrotes subfasciatus, duas importantes pragas do feijÃo-caupi. Ambas as cistatinas apresentaram elevado potencial inibitÃrio contra as enzimas de C. maculatus sendo, porÃm, fracamente ativas contra as de Z. subfasciatus. Bioensaios foram realizados nos quais as cistatinas foram inseridas em sementes artificiais nas concentraÃÃes finais de 0,025; 0,05 e 0,1% e administradas a C. maculatus. A despeito da inibiÃÃo in vitro das enzimas digestivas das larvas de C. maculatus, os resultados do bioensaio sugerem que, tanto larvas como insetos adultos, parecem desenvolver mecanismos adaptativos à administraÃÃo dos inibidores que os tornam insensÃveis à sua ingestÃo. Estudos cristalogrÃficos foram realizados na tentativa de solucionar a estrutura tridimensional das cistatinas. 576 condiÃÃes de cristalizaÃÃo foram testadas das quais trÃs levaram à formaÃÃo e crescimento de cristais difratÃveis de VuCys1. Os cristais pertencem ao grupo espacial ortorrÃmbico, P212121, e a cÃlula unitÃria apresentou dimensÃes de a = 41,48; b = 64,68 e c = 87,91 Ã, α = β = γ = 90. VuCys1 apresenta uma estrutura molecular de dÃmero de domÃnios trocados a qual foi resolvida a uma resoluÃÃo de 1,95 Ã. Cristais de VuCys2 nÃo foram obtidos nas condiÃÃes testadas. O significado fisiolÃgico desta estrutura para a planta, a estabilidade estrutural de ambos inibidores e os resultados referentes aos diferentes bioensaios sÃo discutidos no presente trabalho