Isolation of plastids from developing endosperm of seeds of Jatropha (Jatropha curcas L.)

O pinhÃo manso (Jatropha curcas L.), pertencente à famÃlia Euphorbiaceae, à uma planta oleaginosa com grande potencial para a produÃÃo de biocombustÃvel devido à riqueza de lipÃdios em suas sementes. Ele tambÃm apresenta toxicidade devido à presenÃa de Ãsteres de forbol. Nesse contexto, o objetivo deste estudo à realizar o isolamento de plastÃdios, local de sÃntese de Ãcidos graxos e de Ãsteres de forbol, presentes no endosperma de sementes em desenvolvimento de J. curcas. Experimentos preliminares atravÃs de anÃlises morfolÃgica, histolÃgica e histoquÃmica foram realizados para determinaÃÃo do estÃgio do desenvolvimento da semente mais adequado para o isolamento de plastÃdios presentes no endosperma. Estas anÃlises revelaram que a deposiÃÃo de lipÃdios e proteÃnas no endosperma se inicia por volta do 30o DAA. O isolamento de plastÃdios, do endosperma de sementes nesse estÃgio foi realizado por centrifugaÃÃo em gradiente descontÃnuo de PBF-Percoll (10%, 22%, 35%). A fraÃÃo enriquecida de plastÃdios foi obtida a partir da banda formada na interface da camada de 22-35%. AnÃlises por microscopia eletrÃnica de varredura e de transmissÃo foram realizadas para confirmar a eficiÃncia do protocolo empregado na purificaÃÃo dos plastÃdios. Mapas bidimensionais foram estabelecidos, os âspotsâ detectados nos mesmos serÃo identificados por espectrometria de massa, o que possibilitarà a identificaÃÃo das proteÃnas plastidiais envolvidas na sÃntese dos Ãcidos graxos e dos Ãsteres de forbol no endosperma de sementes de J. curcas.Jatropha (Jatropha curcas L.), belonging to the Euphorbiaceae family, is an oilseed plant with great potential for biofuel production because of the richness of lipids in their seeds. It also presents toxicity due to the presence of phorbol esters. In this context, the objective of this study is the isolation of plastids, the site of synthesis of fatty acids and phorbol esters, present in the endosperm of developing seeds of J. curcas. Preliminary experiments by testing morphology, histology and histochemistry was performed to determine the stage of seed development most suitable for the isolation of plastids present in the endosperm. These analyzes revealed that the deposition of lipids and proteins in the endosperm starts around the 30th DAA. The isolation of plastids, the endosperm of the seeds in this stage was performed by gradient centrifugation PBF-Percoll discontinuous (10%, 22%, 35%). The enriched fractions of plastids has been obtained from the band formed in the interface layer of 22-35%. Analysis by scanning electron microscopy and transmission were performed to confirm the efficiency of the protocol employed in the purification of the plastids. Two-dimensional maps have been laid, the "spots" detected in the same will be identified by mass spectrometry, which will allow the identification of the plastid proteins involved in the synthesis of fatty acids and phorbol esters in the endosperm of seeds J. curcas