Study of cytotoxic potential of new synthetic esters derivatives of the triterpenoid mixture α-/β-amirina in experimental models in vitro.

TriterpenÃides sÃo compostos que nos Ãltimos anos tÃm despertados grande interesse em razÃo de sua diversidade estrutural e da descoberta de um amplo espectro de atividades farmacolÃgicas. O presente estudo avaliou o potencial citotÃxico de quatro derivados de uma mistura de α-,β-amirina em linhagens tumorais humanas. Dentre estes, apenas o composto 3-O-Carboximaleinato de α-, β-amirina (3a/3b) foi ativo, especialmente na linhagem leucÃmica HL-60, com valores de IC50 variando entre 1,8 e 3,0 ÂM. Este derivado foi avaliado, tambÃm frente à outra linhagem leucÃmica, K562, com IC50 variando entre 1,76 e 2,96 ÂM, sugerindo uma especificidade desta substÃncia para leucemias. E sua especificidade para cÃlulas tumorais foi confirmada em ensaios de citotoxicidade em cÃlulas nÃo transformadas, sendo testada em uma linhagem de macrÃfagos, J774 (IC50 entre 3,10 e 3,60 ÂM) e em cÃlulas mononucleares do sangue perifÃrico humano (CMSPH), cuja proliferaÃÃo nÃo foi impedida e nÃo houve dano ao DNA destas cÃlulas. Nenhum dos compostos mostrou atividade hemolÃtica contra eritrÃcitos de camundongos (EC50 > 200 Âg/mL), o que sugere uma citotoxicidade por mecanismos de aÃÃo mais especÃficos. Desta forma, a fim de determinar o mecanismo de aÃÃo envolvido, uma sequÃncia de experimentos in vitro foram realizados na linhagem HL-60. As cÃlulas foram tratadas em diferentes concentraÃÃes da amostra 3a/3b (1,5, 3,0 e 6,0 ÂM) por 24h. A viabilidade das cÃlulas HL-60 (teste azul de tripan e citometria de fluxo) foi reduzida nas concentraÃÃes de 3,0 e 6,0 ÂM, apÃs o tratamento. A anÃlise morfolÃgica das alteraÃÃes celulares realizada por mÃtodos de coloraÃÃo (May-GrÃnwald-Giemsa e laranja de acridina/brometo de etÃdio (LA/BE)) e por citometria de fluxo (integridade de membrana) revelaram caracterÃsticas tÃpicas de cÃlulas apoptÃticas (membrana Ãntegra, reduÃÃo do volume celular, nÃcleo picnÃtico e cromatÃlise), tambÃm nas concentraÃÃes de 3,0 e 6,0 ÂM. Outros testes por citometria de fluxo revelaram que houve externalizaÃÃo da fosfatidilserina, que nÃo houve formaÃÃo de espÃcies reativas de oxigÃnio (EROS) e que a molÃcula 3a/3b induziu apenas a via extrÃnseca da apoptose, pela ativaÃÃo da caspase iniciadora 8 e a consequente ativaÃÃo das caspases efetoras 3 e 7. Estes dados indicam um mecanismo citotÃxico por induÃÃo de uma via apoptÃtica, envolvendo receptores de morte. Por conseguinte, estes resultados apontam o potencial citotÃxico do anÃlogo 3a/3b.Triterpenoids are compounds that in recent years have aroused considerable interest because of their structural diversity and the discovery of a broad spectrum of pharmacological activities. This study evaluated the cytotoxic potential of four derivatives of a mixture of α-, β-amyrin in human tumor cell lines. Among these, only compound 3-O-α-Carboximaleinato of, β-amyrin (3a/3b) was active, especially in the leukemic cell line HL-60, with IC50 values ranging from 1.8 to 3.0 ÂM. This derivative had its cytotoxic evaluated, also at the other leukemia cell line, K562, with IC50 values ranging between 1.76 and 2.96 ÂM, suggesting a specificity of this substance for leukemia. And their specificity for tumor cells was confirmed in cytotoxicity assays in a strain of macrophages, J774 (IC50 between 3.10 and 3.60 ÂM) and mononuclear cells in human peripheral blood mononuclear cells, whose proliferation was not prevented, and there wasnât damage in the DNA of these cells. None of the compounds showed hemolytic activity against erythrocytes of mice (EC50> 200 mg / mL), suggesting a cytotoxic mechanism more specific. Thus, to determine the mechanism of action involved, sequences of in vitro experiments were performed in HL-60 cell line. Cells were treated at different concentrations of the sample 3a/3b (1.5, 3.0 and 6.0 ÂM) during 24h. The viability of HL-60 cells (trypan blue test and flow cytometry) was reduced at concentrations of 3.0 and 6.0 ÂM after treatment. Morphological analysis of cellular changes performed by staining methods (May-GrÃnwald-Giemsa and acridine orange / ethidium bromide (LA / BE)) and by flow cytometry (membrane integrity) showed typical features of apoptotic cells (intact membrane , reduction of cell volume, picnotic nucleus and chromatolysis), also at concentrations of 3.0 and 6.0 ÂM. Further testing by flow cytometry revealed that there was externalization of phosphatidylserine, there was no formation of reactive oxygen species (ROS) and that the molecule 3a/3b only induced the extrinsic pathway of apoptosis by activation of initiator caspase 8 and subsequent activation of caspases 3 and 7. These data indicate a cytotoxic mechanism induced by an apoptotic pathway, involving death receptors. Therefore, these results indicate the cytotoxic potential of 3a/3b analogue