Estudo da imobilização de proteases para a síntese de oligolisinas

Síntese enzimática de peptídeos usando proteases tem atraído uma enorme atenção nos últimos anos. Um desafio chave na síntese de peptídeos é encontrar suportes para imobilização de proteases capazes de apresentar um alto desempenho em meio aquoso, produzindo oligopeptídeos solúveis em água, já que até o presente momento, pouco tem sido descrito usando essa estratégia. Dessa forma, o objetivo dessa tese foi imobilizar proteases usando diferentes métodos (imobilização por ligação covalente, aprisionamento em géis poliméricos de PVA e imobilização em nanopartículas magnéticas de Glicidil) para a produção de oligopeptídeos derivados da lisina. Três proteases foram utilizadas: tripsina, α-quimotripsina e bromelaína. De acordo com as estratégias de imobilização associadas ao tipo de protease empregada, foi provado que os sistemas tripsina-resinas mostraram os melhores desempenhos em termos de atividade hidrolítica e síntese de oligopeptídeos. A atividade hidrolítica das enzimas livres e imobilizadas foi determinada por espectrofotometria com base na mudança de absorbância em 660 nm à temperatura de 25 °C (Casein method). O rendimento de oligolisina e o cálculo do grau de polimerização médio foram monitorados por RMN H. A protease tripsina foi covalentemente imobilizada em quatro diferentes resinas (Amberzyme, Eupergit C, Eupergit CM and Grace 192). O máximo rendimento de proteína imobilizada foi 92, 82, 60, e 71 mg/g de suporte para cada resina, respectivamente. A eficiência desses sistemas (Tripsina-resinas) foi avaliada pela hidrólise do substrato caseína e a síntese de oligolisina em meio aquoso. A maioria dos sistemas foram capazes de catalisar a síntese de oligopeptídeos, entretanto com diferentes eficiências, tais como: 40, 37 e 35% para os suportes Amberzyme, Eupergit C e Eupergit CM, respectivamente, em comparação com a enzima livre. Esses sistemas produziram oligômeros em somente 1 hora com grau de polimerização médio mais alto que a enzima livre. Dentre esses sistemas, Eupergit CTripsina mostrou ser mais eficiente que os outros sistemas em termos de atividade hidrolítica e estabilidade térmica, ao passo que não exibiu a mesma eficiência como era esperado para a síntese de oligolisina. Tripsina-amberzyme provou ser mais eficiente para a síntese de oligopeptídeos, além de exibir um excelente reuso, mantendo 90% de sua atividade hidrolítica e sintética após sete reusos. As interações hidrofóbicas da tripsina com o suporte Amberzyme são responsáveis por proteger a enzima contra as fortes mudanças conformacionais no meio reacional. Além disso, a alta concentração de grupos oxiranos na superfície da resina promoveu ligações covalentes multipontuais e, consequentemente, preveniu a enzima imobilizada do processo de desorção (Leaching process). Os resultados acima mencionados sugerem que a tripsina imobilizada nesses suportes pode ser eficientemente usada para a síntese de oligopeptídeos em meio aquosoEnzymatic synthesis of peptides using proteases has attracted a great deal of attention in recent years. One key challenge in peptide synthesis is to find supports for protease immobilization capable of working in aqueous medium at high performance, producing watersoluble oligopeptides. At present, few reports have been described using this strategy. Therefore, the aim of this thesis was to immobilize proteases applying different methods (Immobilization by covalent bound, entrapment onto polymeric gels of PVA and immobilization on glycidil metacrylate magnetic nanoparticles) in order to produce water-soluble oligopeptides derived from lysine. Three different proteases were used: trypsin, α-chymotrypsin and bromelain. According to immobilization strategies associated to the type of protease employed, trypsin-resin systems showed the best performance in terms of hydrolytic activity and oligopeptides synthesis. Hydrolytic activities of the free and immobilized enzymes were determined spectrophotometrically based on the absorbance change at 660 nm at 25 °C (Casein method). Calculations of oligolysine yield and average degree of polymerization (DPavg) were monitored by 1H-NMR analysis. Trypsin was covalently immobilized onto four different resins (Amberzyme, Eupergit C, Eupergit CM and Grace 192). Maximum yield of bound protein was 92 mg/g, 82 mg/g and 60 mg/g support for each resin respectively. The effectiveness of these systems (Trypsin-resins) was evaluated by hydrolysis of casein and synthesis of water-soluble oligolysine. Most systems were capable of catalyzing oligopeptide synthesis in aqueous medium, albeit at different efficiencies, namely: 40, 37 and 35% for Amberzyme, Eupergit C and Eupergit CM, respectively, in comparison with free enzyme. These systems produced oligomers in only 1 hour with DPavg higher than free enzyme. Among these systems, the Eupergit C-Trypsin system showed greater efficiency than others in terms of hydrolytic activity and thermal stability. However, this did not occur for oligolysine synthesis. Trypsin-Amberzyme proved to be more successful in oligopeptide synthesis, and exhibited excellent reusability, since it retained 90% of its initial hydrolytic and synthetic activity after 7 reuses. Trypsin hydrophobic interactions with Amberzyme support are responsible for protecting against strong enzyme conformational changes in the medium. In addition, the high concentration of oxirane groups on the surface promoted multi-covalent linking and, consequently, prevented the immobilized enzyme from leaching. The aforementioned results suggest that immobilized Trypsin on the supports evaluated can be efficiently used for oligopeptides synthesis in aqueous medi