Avaliação de um método de cromatografia em fase gasosa head space e estudo da estabilidade do etanol em amostras de sangue

O etanol é a droga psicoativa mais utilizada de forma abusiva em todo o mundo, isso faz dele uma das principais substâncias requisitadas em exames toxicológicos na atualidade. O desenvolvimento de um método analítico, a adaptação ou implementação de um método conhecido, envolve um processo de validação que estima sua eficiência na rotina do laboratório e a credibilidade do método. A estabilidade é definida como a capacidade da amostra do material manter o valor inicial de uma medida quantitativa por um período definido dentro de limites específicos quando armazenados sob condições definidas. Este trabalho teve como objetivo avaliar o método de Cromatografia em fase gasosa e estudar a estabilidade do etanol em amostras de sangue, considerando as variáveis tempo e temperatura de armazenamento, bem como a presença de conservante e, com isso verificar se as condições de conservação e armazenamento utilizadas neste estudo mantêm a qualidade da amostra e preservam a quantidade inicialmente presente do analito. Foram coletadas amostras de sangue de 10 voluntários para avaliação do método e para o estudo da estabilidade do etanol. Para a avaliação do método, parte das amostras foi adicionada de concentrações conhecidas de etanol. No estudo da estabilidade, a outra parte do pool de sangue foi colocada em dois recipientes: um contendo o conservante fluoreto de sódio 1% e o anticoagulante heparina e no outro somente heparina, foi adicionado etanol na concentração de 0,6 g/L, fracionado em dois frascos, sendo um armazenado a 4ºC (geladeira) e outro a -20ºC (freezer). As análises foram realizadas no mesmo dia (tempo zero) e após 1, 3, 7, 14, 30 e 60 dias de armazenamento. A avaliação considerou a diferença dos resultados durante o armazenamento em relação ao tempo zero. Foi utilizada a técnica de head space associada à cromatografia em fase gasosa com detector de ionização de chama e coluna capilar com fase estacionária de polietilenoglicol. As melhores condições cromatográficas de análise obtidas foram: temperatura de 50ºC (coluna), 150ºC (injetor) e 250ºC (detector), com tempo de retenção para o etanol de 9,107 ± 0,026 e para o t-butanol (padrão interno) de 8,170 ± 0,081 minutos, sendo o etanol separado adequadamente do acetaldeído, acetona, metanol e isopropanol, que são potenciais interferentes na determinação do etanol. A técnica mostrou linearidade no intervalo de concentração de 0,01 e 3,2 g/L (y = 0,8051x + 0,6196; r2 = 0,999). A curva de calibração apresentou a seguinte equação da reta: y = 0,7542x + 0,6545, com um coeficiente de correlação linear igual a 0,996. A recuperação média foi de 100,2%, os coeficientes de variação da precisão intraensaio e interensaio apresentaram valores de no máximo 7,3%, o limite de detecção e quantificação foi de 0,01 g/L e apresentou coeficiente de variação dentro do permitido. O método analítico avaliado no presente trabalho demonstrou ser rápido, prático e eficiente, atendendo satisfatoriamente aos objetivos do trabalho. O estudo da estabilidade demonstrou diferença menor que 20% na resposta obtida nas condições de armazenamento e período estipulados, comparada com a resposta obtida no tempo zero e, ao nível de significância de 5%, nenhuma diferença estatística na concentração de etanol foi observada entre as análises. Os resultados obtidos reforçam a confiabilidade do método de cromatografia em fase gasosa e das amostras de sangue na pesquisa de etanol, seja na área toxicológica, Forense, social ou clínicaThe ethanol is the most overused psychoactive drug over the world; this fact makes it one of the main substances required in toxicological exams nowadays. The development of an analytical method, adaptation or implementation of a method known, involves a process of validation that estimates its efficiency in the laboratory routine and credibility of the method. The stability is defined as the ability of the sample of material to keep the initial value of a quantitative measure for a defined period within specific limits when stored under defined conditions. This study aimed to evaluate the method of Gas chromatography and study the stability of ethanol in blood samples, considering the variables time and temperature of storage, and the presence of preservative and, with that check if the conditions of conservation and storage used in this study maintain the quality of the sample and preserve the originally amount of analyte present. Blood samples were collected from 10 volunteers to evaluate the method and to study the stability of ethanol. For the evaluation of the method, part of the samples was added to known concentrations of ethanol. In the study of stability, the other side of the pool of blood was placed in two containers: one containing the preservative sodium fluoride 1% and the anticoagulant heparin and the other only heparin, was added ethanol at a concentration of 0.6 g/L, fractionated in two bottles, one being stored at 4ºC (refrigerator) and another at -20ºC (freezer), the tests were performed on the same day (time zero) and after 1, 3, 7, 14, 30 and 60 days of storage. The assessment found the difference in results during storage in relation to time zero. It used the technique of headspace associated with gas chromatography with the FID and capillary column with stationary phase of polyethylene. The best analysis of chromatographic conditions were: temperature of 50ºC (column), 150ºC (jet) and 250ºC (detector), with retention time for ethanol from 9.107 ± 0.026 and the tercbutanol (internal standard) of 8.170 ± 0.081 minutes, the ethanol being separated properly from acetaldehyde, acetone, methanol and 2-propanol, which are potential interfering in the determination of ethanol. The technique showed linearity in the concentration range of 0.01 and 3.2 g/L (0.8051 x + y = 0.6196; r2 = 0.999). The calibration curve showed the following equation of the line: y = x 0.7542 + 0.6545, with a linear correlation coefficient equal to 0.996. The average recovery was 100.2%, the coefficients of variation of accuracy and inter intra test showed values of up to 7.3%, the limit of detection and quantification was 0.01 g/L and showed coefficient of variation within the allowed. The analytical method evaluated in this study proved to be fast, efficient and practical, given the objective of this work satisfactorily. The study of stability has less than 20% difference in the response obtained under the conditions of storage and stipulated period, compared with the response obtained at time zero and at the significance level of 5%, no statistical difference in the concentration of ethanol was observed between analysis. The results reinforce the reliability of the method of gas chromatography and blood samples in search of ethanol, either in the toxicological, forensic, social or clini