Purificação e caracterização parcial de uma B-D glicosidade de Artemia franciscana com ação sobre celobiose e lactose

-D-glicosidase (EC 3.2.1.21) é uma das mais interessantes glicosidases, especialmente por hidrolisar celobiose liberando glicose, último passo de degradação de celulose. Esta função faz com que a -D-glicosidase seja de grande interesse como um versátil biocatalizador industrial, sendo critica para vários processos de bio-tratamento / biorrefinaria, como produção de bioetanol. Neste trabalho, uma -D-glicosidase extraída de extratos protéicos do invertebrado marinho Artemia franciscana foi purificada e caracterizada com uma combinação de precipitação com sulfato de amônio (30; 50; 80%), a fração saturada na faixa de 50% (chamada F-II) foi aplicada em uma cromatografia de exclusão molecular em Sephacryl S-200, as frações correspondentes ao primeiro pico de atividade da -D-glicosidase foram reunidas e aplicadas numa cromatografia de troca iônica em Mono Q; o terceiro pico protéico obtido nessa cromatografia, o qual coincide com o pico de atividade da -D-glicosidase, foi reunido e aplicado numa cromatografia gel filtração Superose 12 onde o primeiro pico protéico, o qual possui atividade da -D-glicosidase, foi recromatografado em Superose 12. Esta enzima provavelmente é multimerica, constituída por três subunidades, de massa molecular de 52,7 kDa (determinado por SDS-PAGE) e com massa molecular nativa de 157 kDa (determinado por cromatografia gel filtração em Superose 12 sob o sistema FPLC). A enzima foi purificada 44,09 vezes com uma recuperação de 1,01%. Utilizando-se -nitrofenil--D-glicopiranosídeo como substrato obtivemos uma Km aparente de 0,229 mM (12,7 M de produto/cm/hora) e Vmáx de 1,109 mM.60min-1.mL-1. O pH ótimo e a temperatura ótima de catálise do substrato sintético foram 5,0 e 45C, respectivamente. A atividade -D-glicosidásica foi fortemente inibida por nitrato de prata e N-etilmaleimida, esta inibição indica o envolvimento de radicais sulfidrila na hidrólise do substrato sintético. A -D-glicosidase de Artemia franciscana apresentou ação degradativa sobre celobiose, lactose e sobre o substrato sintético -nitrofenil--D-glicopiranosídeo, indicando potencial uso desta enzima na indústria principalmente para produção de bioetanol (produção de álcool a parti de celulose) e produção de leite hidrolisado (leite destituído de lactose)-D-glucosidase (EC 3.2.1.21) is one of the most interesting glycosidases, especially for hydrolysis cellobiose releasing glucose, is last step degradation of cellulose. This function makes the -D-glucosidase is of great interest as a versatile industrial biocatalyst, being critical to various bio-treatment / biorefinery processes, such as bioethanol production. Hen in the report, a -D-glucosidase was extracts from protein extracted of the invertebrate marine Artemia franciscana was purified and characterized with a combination of precipitation with ammonium sulfate (0 - 30%, 30 to 50%, 50 to 80%), the fraction saturated in the range of 30 to 50% (called F-II) was applied in a molecular exclusion chromatography, in Sephacryl S-200, the fractions corresponding to the first peak of activity of -D-glucosidase were gathered and applied in a chromatography of ion exchange in Mono Q; the third peak this protein obtained chromatography, which coincides with the peak of activity of -D-glucosidase was held and applied in a gel filtration chromatography Superose 12 where the first peak protein, which has activity of -D-glucosidase was rechromatography on Superose 12. This enzyme is probably multimerica, consisting of three subunit molecular mass of 52.7 kDa (determined by SDS-PAGE) with native molecular mass of 157 kDa (determined by gel filtration chromatography on Superose 12 under the system FPLC). The enzyme was purified 44.09 times with a recovery of 1.01%. Using up p-nitrophenyl-β-D-glucopiranoside as substrate obtained a Km apparent of 0.229 mM and a Vmax of 1.109 mM.60min-1.mL-1mM. The optimum pH and optimum temperature of catalysis of the synthetic substrate were 5.0 and 45 °C, respectively. The activity of the -D-glucosidase was strongly, inhibited by silver nitrate and N- etylmaleimide, this inhibition indicates the involvement of radical sulfidrila the hydrolysis of synthetic substrate. The -D-glucosidase of Artemia franciscana presented degradativa action on celobiose, lactose and on the synthetic substrate -nitrophenyl-β-D-glucopiranoside indicating potential use of this enzyme in the industry mainly for the production of bioethanol (production of alcohol from the participating cellulose), and production hydrolysate milk (devoid of milk lactose