β-frutofuranosidases em coleópteros: caracterização funcional e produção heteróloga de uma β-frutofuranosidase de Sphenophorus levis

O coleóptero Sphenophorus levis é uma importante praga da cana-de-açúcar, para o qual ainda não existe um método de controle adequado. Considerando a importância da cultura canavieira no Brasil, maior produtor e exportador de açúcar e segundo maior produtor de etanol no mundo, um estudo transcriptômico das larvas do inseto foi realizado anteriormente a este trabalho para a identificação do seu arsenal digestivo. Dentre as prováveis enzimas digestivas, foram identificadas sequências que codificam uma enzima da classe das β-frutofuranosidases. O sequenciamento do clone de cDNA foi totalizado e verificou-se a presença de sinal de poliadenilação e cauda poli-A característica de eucariotos, bem como uma região codificadora para um provável peptídeo sinal para secreção da enzima. A comparação da sequência proteica deduzida com o banco de dados do NCBI aponta maior similaridade com invertases bacterianas. A amplificação do gene da β-frutofuranosidase de S. levis (Sl-β-fruct) por PCR a partir de DNA genômico, livre de contaminação bacteriana, sugere que S. levis realmente codifica uma β-frutofuranosidase. Comparando-se sequências de aminoácidos de β- frutofuranosidases de coleópteros, observam-se regiões conservadas entre membros da família Curculionidae. O ensaio bioquímico das glicosidases intestinais de S. levis mostrou que existem provavelmente duas β-frutofuranosidases responsáveis pela digestão de sacarose. Portanto, o inseto pode apresentar uma isoforma da Sl-β-fruct ou se beneficiar de uma invertase produzida pela própria microbiota. As análises de expressão via PCR quantitativo em tempo real revelaram que o gene é expresso em intestino médio, nas fases de alimentação do inseto, característica de uma enzima digestiva. As análises filogenéticas indicaram que Sl-β-fruct é similar a outras β- frutofuranosidases de lepidópteros e coleópteros, mas se apresenta mais próxima das enzimas bacterianas. Essa proximidade se dá a grupos distintos de bactérias, quando comparada com enzimas de lepidópteros, levando-nos a propor um evento de transferência horizontal independente do que ocorreu em lepidópteros. A fase aberta de leitura (ORF) codificadora da enzima, excluindo o peptídeo sinal, foi clonada no plasmídeo pPICZα-A para sua produção heteróloga em Pichia pastoris. A enzima produzida (rSl-β-fruc) apresentou-se glicosilada, com massa molecular aproximada de 65 kDa. Os ensaios de especificidade ao substrato confirmaram que a enzima é uma β- frutofuranosidase. A rSl-β-fruc apresentou pH de maior atividade próximo a 5,0 e temperatura de atividade máxima próxima a 50 C. Os ensaios de termoestabilidade e resistência térmica sugerem uma baixa capacidade térmica para rSl-β-fruc, que se desnatura com facilidade. Os sais Dodecil Sulfato de Sódio (SDS) e MgCl2 provocam inibição da rSl-β-fruc na concentração de 1 mM. As constantes cinéticas estimadas para a rSl-β-fruct foram Km = 20,02 mM, Vmax = 105,7 μM.s-1 e kcat = 520,9 s-1. O presente estudo expande o conceito da ocorrência de β-frutofuranosidases em coleópteros. Apesar dos poucos relatos desse gene no reino animal, é possível afirmar que a β- frutofuranosidase é importante e vem sendo mantida entre algumas espécies de lepidópteros e coleópteros. Tratando-se das potencialidades que a rSl-β-fruct apresenta para uma aplicação industrial, observa-se um potencial positivo caso haja melhorias em sua estabilidade térmica