Ensaios bioquímicos e celulares para a identificação de novos inibidores de TcGAPDH seletivos à HsGAPDH

A doença de Chagas e uma doença tropical negligenciada que afeta aproximadamente 10 milhões de indivíduos, no ano de 2008 foi responsável pela morte de cerca de 10 mil pessoas. Os tratamentos que existem atualmente são empregados apenas na fase aguda da doença, utilizando os fármacos benzonidazol e o nifurtimox, demonstrando ambos diversos efeitos indesejáveis. Apesar da existência de alguns estudos na área, não ha registro de nenhum novo fármaco para o tratamento da doença de Chagas. Dessa forma, a busca por novas moléculas bioativas para o tratamento desta doença e de fundamental importância. A enzima gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) de Trypanosoma cruzi aparece como um alvo promissor para pesquisa de novos fármacos para doença de Chagas, uma vez que essa enzima participa da via glicolitica, que a principal via para obtenção de energia do parasito. Neste trabalho foram realizados ensaios de inibição utilizando uma classe de compostos contra a TcGAPDH. A técnica utilizada para o estudo dos compostos foi a calorimetria de titulação isotérmica (ITC), que mede a troca de calor observada durante uma reação e vem sendo utilizada atualmente para a determinação de parâmetros termodinâmicos e cinéticos. Os compostos estudados apresentaram atividade inibitória frente a enzima TcGAPDH e sua homologa GAPDH de humanos. Foram estudados oito compostos análogos ao cofator NAD+. Os valores da constante de inibição aparente (Ki app) dos compostos estão no intervalo de 15,98 a 91,25 M com mecanismo de inibição competitivo. A descoberta e desenvolvimento de fármacos baseiam-se em sistemas modelos introduzidos no inicio dos projetos em química medicinal. A otimização in vitro usando ensaios bioquímicos e cultura de células representa uma opção viável no novo paradigma da química medicinal moderna. No caso dos estudos celulares, modelos são estudados para mimetizar as células humanas, especialmente com relação a atividade da GAPDH. Dessa forma, o Saccharomyces cerevisiae foi usado como modelo para que a atividade VII citotóxica dos compostos fosse detectada por espectroscopia de fluorescência. Cinco dos oito compostos não apresentaram atividade contra a levedura, sendo um bom indicativo que as moléculas apresentam baixa cito toxidade tornando-as candidatas para os estudos in vitro no parasito T.cruzi.Chagas disease is a tropical neglected illness; nearly 10 million people are infected, in 2008 it was responsible for the deaths of about 10 thousand people. At present, only two medicines (benznidazol and nifurtimox) are available to treat this disease and they lack of efficacy/safety in chronic phase. This scenario is changing due to advances in the search for new trypanocidal agents. The glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), a glycolytic enzyme of Trypanosoma cruzi appears as a suitable target for drug discovery. In the present work, a kinetic study using Isothermal Titration Calorimetry (ITC) were carried out to investigate the activity of eight NAD+ analogs against GAPDH. ITC was been used to measure the heat exchange during reactions making it a powerful tool of identification of bioactive compounds. Study compounds showed inhibitory activity on TcGAPDH enzyme and its homologous human GAPDH. The apparent inhibition constant values (Ki app) were in the range from 15,98 to 91,25 M describing competitive inhibition mechanisms. Important steps in medicinal chemistry maybe biochemical followed by cell-based assays were, for instance, Saccharomyces cerevisiae could be used as a model to assess the cytotoxic activity of compounds. The technique used to study the action of chemical compounds in yeast was the fluorescence spectroscopy. Five out of eight compounds showed no activity against S. cerevisiae. This is a good indication that study compounds have low cytotoxicity, which makes them candidates for in vitro studies on the parasite