Search of cathepsin k inhibitors in medicinal plants used in the treatment of diseases osteoarthritis

Dez plantas utilizadas pela medicina tradicional com indicativos na literatura de suas eficácias frente a doenças osteoarticulares foram selecionadas para a realização de uma triagem de atividade inibitória frente à catepsina K, uma importante enzima responsável pela clivagem do colágeno, principal constituinte da matriz extracelular da cartilagem e ossos. Das dez plantas selecionadas (gengibre, açafrão, camélia, unha-de-gato, mentrasto, moringa, babaçu, garra-do-diabo, urtigão e pequi), uma, gengibre (Zingiber officinale), merece destaque pela alta inibição de seu extrato e frações frente à catepsina K e por seu uso milenar como agente terapêutico. Da fração de diclorometano obtida do extrato bruto dos rizomas de Z. officinale isolou-se e identificou-se 18 substâncias (4-gingerol, 6-gingerol, 8-gingerol, 6-shogaol, 8- shogaol, 10-shogaol, 6-paradol, 6-gingerdiol, metil-6-gingerol, metil-6-shogaol, diacetato de 6-gingerdioila, diacetato de metil-6-gingerdioila, zingerona, gingerenona A, galanolactona, 3-acetato de 5-hidroxi-1,7-bis(4-hidroxi-3-metoxifenil)-heptila e hexaidrocurcumina). Da fração de n-hexano e do óleo essencial, foram identificados 2 monoterpenos e 4 sesquiterpenos. As substâncias mais ativas frente à catepsina K foram os gingerois e shogaois de maior cadeia alquílica. Otimização da separação das substâncias majoritárias (6, 8 e 10-gingerol) e um estudo de sobrecarga de uma coluna C18 por CLAE, foram realizados, obtendo-se como resultado o isolamento de dezenas a centenas de miligramas de cada gingerol com considerável grau de pureza. Modificações estruturais do 6-gingerol foram realizadas e, das sete substâncias obtidas, 4 tiveram um aumento considerável do poder inibitório. Das substâncias obtidas, três, SSi6, 10-gingerol, 6-shogaol, foram selecionadas para ensaios posteriores: determinação do tipo de inibição frente à catepsina K, inibição da catepsina K e inibição da produção de óxido nítrico (NO), em meio celular. As inibições determinadas foram não-competitiva parcial, acompetitiva parcial e acompetitiva completa, para o SSi6, 10-gingerol e 6-shogaol, respectivamente. Excelentes atividades de inibição frente à catepsina K, em meio celular, puderam ser observadas para o SSi6 e 6-shogaol. No ensaio de inibição da produção de NO, o 6- shogaol foi a única substância que se apresentou como efetivo.Ten herbs used in traditional medicine supported by literature for its effectiveness to osteoarticular diseases were selected to conduct a screening of inhibition activity against the cathepsin K, an important enzyme responsible for cleavage of collagen, the main constituent of extracellular matrix of cartilage and bone. Out of the ten herbs selected (ginger, saffron, camellia, cats claw, mentrasto, moringa, babaçu, devils claw, urtica e pequi), one, gengibre (Z. officinale), should be highlighted by a high inhibitory activity of its extracts and fractions against cathepsin K and due to its ancient use as a therapeutic agent. From the dichloromethane fraction obtained of the crude extract of the rhizome of Z. officinale were isolated and identified 18 compounds (4-gingerol, 6-gingerol, 8-gingerol, 6-shogaol, 8-shogaol, 10-shogaol, 6- paradol, 6-gingerdiol, methyl 6-gingerol, methyl 6-shogaol, diacetoxy-6-gingerdiol, methyl diacetoxy-6-gingerdiol, zingerone, gingerenone A, galanolactone, 3-acetoxy- 5-hydroxy-1,7-bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-heptane and hexahydrocurcumin). From the hexane fraction and essential oil were identified two monoterpenes and four sesquiterpenes. The most active compounds against cathepsin K were gingerols and shogaols with longer alkyl chain. Optimization of the separation of major compounds (6, 8 and 10-gingerol) and an overload study of C18 column was performed using HPLC, obtained as result dozens to hundreds of milligrams of each gingerol with high purity. Structural modifications of 6-gingerol were carried out and of the seven derivatives obtained 4 presented significant increase in inhibition of cathepsin K. Of all the compounds, three, SSi6, 10-gingerol, 6-shogaol, were selected for later tests: determinating of the mode the inhibition against cathepsin K, inhibition against cathepsin K and inhibition of nitric oxide (NO) production, in cellular culture. The inhibitions determined were: partially noncompetitive, partially uncompetitive and complete uncompetitive for the SSi6, 10-gingerol and 6-shogaol, respectively. Excellent inhibition activity against the cathepsin K, in cellular culture, can be observed for SSi6 and 6-shogaol. In the inhibition assay of NO production, the 6- shogaol was the only compound that appeared as effective