Comportamento bioquímico e fisiológico de sementes florestais nativas durante a embebição.

Este trabalho teve como objetivo estudar as modificações bioquímicas e fisiológicas com ênfase nas atividades da enzima alfa-galactosidase ocorrendo durante a embebição de sementes Platymiscium pubescens (Micheli), Tachigalia multijuga (Benth) e Caesalpinia peltophoroides (Benth) submetidas a diferentes tratamentos. Sementes osmocondicionadas de Platymiscium pubescens foram osmocondicionadas em solução de polietilenoglicol (PEG 6.000), sendo analisadas as alterações no teor de água, no crescimento do eixo embrionário, na germinação, as alterações na parede celular, a mobilização de carboidratos e proteínas e a atividade de alfa-galactosidase. Observou-se que a umidade das sementes mantidas em água estabilizou a posteriori as daquelas mantidas em solução de PEG 6000. A germinação das sementes mantidas em água, consideradas como testemunha, alcançaram 30% em 120 horas. Enquanto a massa fresca e o comprimento do eixo embrionário aumentaram significativamente durante a permanência na solução de PEG, a massa fresca não foi alterada significativamente. A arabinose é o principal açúcar constituinte da membrana que recobre o embrião, tendo ela e a xilose, decréscimos significativos durante a permanência em solução de PEG 6000. A atividade da alfagalactosidase do embrião apresentou alterações significativas durante o período de 120 horas em que esteve na solução de PEG. Os teores de ramnose, arabinose e xilose foram alterados significativamente na fração péctica, enquanto a ramnose foi a única na fração hemicelulósica, da parede do eixo embrionário. Os teores de glicose foram reduzidos significativamente, tanto no eixo embrionário, quanto nos cotilédones durante o osmocondicionamento. Os teores de estaquiose e de rafinose não apresentaram alterações significativas nos cotilédones, enquanto o de sacarose foi reduzido significativamente. Os teores de proteínas decresceram significativamente nas 120 horas de osmocondicionamento. Concluiu-se que o osmocondicionamento potencializou a germinação das sementes durante o processo de embebição, resultando em modificações da parede celular pela deposição de monossacarídeos. Tendo em vista as alterações significativas observadas na atividade de alfa-galactosidase em sementes de P. pubescens durante o osmocondicionamento e a sua possível participação na germinação, este trabalho foi desenvolvido para caracterizar a enzima no embrião e nos cotilédones das sementes dessa espécie. As sementes foram colocadas para embeber em água, sendo retiradas amostras para as caracterizações bioquímicas e cinéticas da enzima do eixo embrionário e cotilédones. Enquanto a atividade específica no eixo aumentou durante 96 horas, a dos cotilédones mostrou pequeno incremento. A atividade da alfa-galactosidase do eixo foi máxima no intervalo de pH de 4,5 a 6,0 e a dos cotilédones em 6,0. A temperatura de 55C foi a que mais estimulou a atividade das enzimas de ambos compartimentos. As termoestabilidades das enzimas do eixo e dos cotilédones foram mantidas por 1.500 horas na temperatura de 40C. A atividade da alfa-galactosidase do eixo embrionário foi inibida por melibiose, CuSO4 e SDS, enquanto a dos cotilédones por todos os efetores, com exceção de galactose, SDS e CuSO4. Os valores de KM para o embrião e para os cotilédones foram 3,37 e 0,26 mM, respectivamente, indicando que as alfa-galactosidases são diferentes e com atividades em tempos diferentes durante a embebição. Da mesma forma, caracterizou-se a alfagalactosidase de embrião e cotilédones de sementes de Caesalpinia peltophoroides e procurou-se estabelecer a relação entre a sua atividade e as alterações na parede celular da micrópila nas sementes. Durante 144 horas de embebição foram retiradas amostras para quantificação da atividade de alfa- galactosidase, de proteína e de açúcares. A germinação ocorreu com 96 horas de embebição, sem que houvesse modificações na parede celular da micrópila. Nesta, observou-se maior proporção de arabinose que mostrou tendência de aumento com o decorrer da embebição. A atividade da enzima foi detectada tanto em sementes secas, tanto no eixo embrionário, quanto nos cotilédones, aumentando no primeiro a partir de 24 horas de embebição. O teor de proteína decresceu continuamente no eixo embrionário a partir de 24 horas de embebição, enquanto se manteve estável nos cotilédones. A atividade da alfa-galactosidase foi máxima nas temperaturas de 55C para o eixo embrionário e 50C para os cotilédones. A faixa de pH que mais estimulou a atividade da enzima foi de 5,5 a 6,0 para o eixo embrionário e de 4,5 a 5,0 para os cotilédones. As alfagalactosidases do eixo embrionário e dos cotilédones foram inibidas por melibiose, CuSO4, SDS e galactose. Por outro lado, o mercaptoetanol estimulou a atividade dos cotilédones. A termoestabilidade também mostrou-se alta na temperatura de 50C. Os KM para o substrato r -NPGal para a alfa-galactosidase do embrião e dos cotilédontes foram 1,74 e 2,64, respectivamente. Percebe-se que as alfa-galactosidases das duas espécies são também diferentes entre si, denotando-se especificidade, com atuações distintas, próprias do ecotipo de cada espécie. Com o objetivo de estudar o efeito de tratamentos pré-germinativos nas atividades das enzimas alfa-galactosidase e da beta-mananase, na porcentagem de embebição, na porcentagem e velocidade de germinação, na síntese de proteínas e na alteração na membrana que recobre o embrião em sementes de Tachigalia multijuga, foram coletadas sementes de três matrizes aplicando-se tratamentos de ácido sulfúrico, da água fervente e do desponte. Não houve germinação nas sementes tratadas com água quente. Com exceção do ácido sulfúrico por 10 minutos, todos os demais tratamentos resultaram em porcentagem de germinação superior ao da testemunha. Por outro lado, a velocidade de germinação dos diversos tratamentos foi diferente da testemunha somente em uma das matrizes. As porcentagens de água das sementes tratadas com ácido por 20 minutos e por água quente por 60 segundos diferiram estatisticamente da testemunha. As atividades das enzimas e teores de proteínas durante a embebição foram diferentes estatisticamente entre os tratamentos com água e ácido. Enquanto a alfa-galactosidase no tratamento com água quente permaneceu constante durante a embebição, aquelas do ácido sulfúrico aumentaram durante o período de 96 horas, decrescendo em seguida. Por outro lado, a atividade da beta-mananase não foi detectada após 96 horas no tratamento com água quente e aumentou significativamente no de ácido sulfúrico. Verificou-se que, de modo geral, os teores de todos os açúcares componentes do tegumento das sementes da testemunha foram significativamente inferiores aos daqueles dos dois tratamentos pré-germinativos, especialmente em 144 horas de embebição. Conclui-se que não há relação entre a atividade de ambas enzimas e as alterações ocorridas nos tegumentos das sementes, devendo essas enzimas, estarem atuando na mobilização de reservas e não no enfraquecimento do tegumento na fase prégerminativa.This work aimed to study the biochemical and physiological changes, with emphasis on alpha-galactosidase enzyme, which occur during the germination of Platymiscium pubescens, Tachigalia multijuga and Caesalpinia peltophoroides seeds submitted to different treatments. Platymiscium pubescens seeds were osmoconditioned in polyethilenoglycol (PEG, m.w. 6,000) and the alterations in water content, embryonic axis growth, germination, cellular wall, protein carbohydrate mobilization and alpha-galactosidase were analyzed. Moisture of seeds maintained in water stabilized after the moisture of those maintained in PEG. The germination of water-maintained seeds, which were regarded as control, reached 30% in 120 h. While the fresh mass and embryonic axis length increased significantly during permanence in the PEG solution, fresh mass did not alter significantly. Arabinose was found to be the main constituent of the membrane surrounding the embryo and, together with xylose, showed significant decreases during permanence in the PEG solution. Alpha-galactosidase activity underwent significant changes during the 120 h period in the PEG solution. Rhamnose, arabinose and xylose contents altered significantly in the pectic fraction, while rhamnose was the only one found in the hemicellulosic fraction of the embryonic axis wall. Glucose contents reduced significantly both in the embryonic axis and in the cotyledons during osmocondioning. Stachyose and raffinose contents had no significant alterations in the cotyledons while sucrose content reduced significantly. Protein contents decreased significantly during the 120h osmoconditioning. It was concluded that osmoconditioning potentialized seed germination during the imbibing process, resulting in cellular wall changes due to the deposition of reducing sugars. In view of the significant alterations observed in alpha-galactosidase activity in P. pubescens seeds during osmoconditioning and its likely involvement in the germination process, this work was developed to characterize the enzyme in the embryo and in the cotyledons of seeds of this species. The seeds were placed to imbibe in water and samples withdrawn for biochemical and kinetic characterization in the embryonic axis and cotyledons. While the specific activity in the axis increased during 96 h, cotyledon activity showed a small increase. Alpha-galactosidase activity in the axis was maximal during the pH interval from 4.5 to 6.0 and cotyledon activity at 6.0. The 55 oC temperature stimulated enzyme activity the most in both compartments. The thermo-stabilities of the axis and cotyledon enzymes were maintained for 1,500 h at 40 oC. The Alpha-galactosidase activity in the embryonic axis was inhibited by melibiosis, CuSO4 and SDS whereas that of the cotyledons was inhibited by all the effectors. KM values for the embryo and cotyledons were 3.37 and 0.26 mM, respectively, showing that the alphagalactosidases are different and have activities at different times during imbibition. Similarly, the alpha-galactosidase of the embryo and cotyledons of Caesalpinia peltophoroides seeds was characterized, aiming to establish the relationship between its activity and the alterations in the cellular wall of the micropyle in the seeds. During the 114 h imbibition, samples were withdrawn for quantification of alpha-galactosidase activity, protein and sugars. Germination took place after 96 h imbibition, without any changes occurring in the cellular wall of the micropyle, where a greater proportion of arabinose, with a tendency to increase during imbibition, was observed. Enzyme activity was detected in dry seeds, in the embryonic axis and in the cotyledons, increasing in the first after 24 h imbibition. Protein content decreased continuously in the embryonic axis, after 24 h imbibition, while maintaining itself stable in the cotyledons. Alpha- galactosidase activity was maximal at temperatures of 55 oC for the embryonic axis and 50 oC for the cotyledons. The pH that stimulated enzyme activity the most was in the range of 5.5 - 6.0 for the embryonic axis and 4.5 - 5.0 for the cotyledons. Melibiosis, CuSO4, SDS and galactose inhibited the alphagalactosidases of the embryonic axis and cotyledons. On the other hand, mercaptoethanol stimulated the activity of the cotyledons. Thermo stability was also shown to be high at the temperature of 50 oC. The KM for the substrate r - NPGal for the alpha-galactosidase of the embryo and cotyledons was 1.74 and 2.64, respectively. The alpha-galactosidases of the two species were also found to be different from each other, with specificities and distinct behaviors characteristic of the ecotype of each species. Aiming to study the effect of the pre-germinating treatments on the activities of the enzymes alpha-galactosidase and beta-mannanase, in the imbibition percentage, germination percentage and velocity, protein synthesis and alteration of the membrane surrounding the embryo in seeds of Tachigalia multijuga, seeds of three selected trees were collected and sulphuric acid, snipped of seeds testa at micropyle end or at the other end and boiling water treatments were applied. No seed germination occurred in the boiling water treatment. Except for the sulphuric acid for 10 min, all the other treatments resulted in germination percentage greater than the control. On the other hand, germination velocity in the various treatments was different from that of the control only in one of the trees. Seeds water percentage of the ones treated in acid for 20 min. and boiling water for 60 sec differed statistically from the control. The enzyme activities and protein contents during imbibition were statistically different between the water and acid treatments. While the alpha-galactosidase remained constant in the boiling water treatment, during imbibition, those in the sulphuric acid increased during the 96 h period, followed by a decrease. In contrast, beta-mannanase activity was not detected after 96 h. in the hot water treatment, increasing significantly in the sulphuric acid treatment. It was verified that, overall, the contents of all the sugar components of the seed teguments in the control, were significantly lower than those in the two pre-germinating treatments, especially during 144 h imbibition. It was concluded that there is no relation between the activity of either enzyme and the alterations in the seed teguments, with the likelihood of both enzymes acting on mobilization of reserves rather than on the weakening of the tegument in the pre-germinating phase