Optimization of detection of Ratoon Stunting Disease and Leaf Scald Disease in sugarcane by PCR

O cultivo de cana-de-açúcar está em expansão no Brasil, devido ao crescente consumo de etanol por carros bicombustíveis. A área plantada está em crescimento, mas a produtividade nos últimos anos vem decrescendo, e fatores como incidência de doenças podem estar contribuindo para tal situação. Dentre as doenças, as bacterianas, como o Raquitismo das Soqueiras e a Escaldadura das Folhas, possuem grande importância para a cultura, pois podem reduzir a produtividade em até 30% e nem sempre os sintomas são visualizados em campo, necessitando assim de técnicas avançadas de detecção. Dentre as técnicas para diagnose, a mais utilizada por laboratórios são os testes sorológicos, que tem como vantagem detectar quantitativamente a presença das bactérias nos colmos mas, no entanto, possui a desvantagem de detectar somente quando a população bacteriana está relativamente alta. A técnica de PCR é mais sensível, detectando níveis baixos da população dessa bactéria nos colmos, e as etapas de extrações de DNA devem purificar o DNA para a redução da presença de substâncias inibidoras presentes no extrato. Assim, neste trabalho foram testadas cinco diferentes metodologias de extração de DNA para Xanthomonas albilineans e Leifsonia xyli subsp. xyli realizadas em três fontes: bactérias puras, bactérias adicionadas diretamente no caldo de cinco diferentes variedades de cana-de-açúcar, e caldo de colmos infectados com as bacterioses. Os resultados demonstram que as amplificações acontecem com maior freqüência e repetibilidade quando os produtos das extrações são diluídos em uma proporção de 10-4 para Escaldadura das folhas. Sem diluições as amplificações não ocorrem, mesmo com o método de extração de DNA com elevado grau de pureza, tal como CTAB. Assim, conclui-se que a detecção não ocorre se o produto das extrações de DNA não for diluído ao menos 1000 vezes, provavelmente reduzindo-se desta forma, o nível de inibidores presentes, proporcionando resultados positivos na técnica de amplificação via PCR. Para Raquitismo das soqueiras não conseguimos detectar Leifonia xyli subsp. xyli através de métodos rápidos de extração de DNA.The sugarcane production areas are increasing in Brazil due to increased ethanol consumption by flex fuel cars. The planted area is growing, but productivity has been declining in recent years, and factors such as incidence of diseases in the crop may be contributing to this situation. Among the diseases, bacteria such as scald of the leaves and ratoon stunting disease, are of great importance to the crop because they can reduce productivity by up to 30% and the symptoms are not always displayed in the field, thus requiring advanced techniques to detect such bacterial diseases. Among the most used techniques for diagnosis serological tests are quite common, which has as main advantage the capacity of quantitative detection of the presence of bacteria in the culms. However, this detection is only possible if the bacterial title is relatively high. The PCR technique method is more sensitive for detecting low levels of bacteria in stems, but the DNA extractions should be performed in order to purify the DNA to reduce the presence of inhibitory substances in the extract. Thus in this study five different methods of DNA extraction of Xanthomonas albilineans and Leifsonia xyli subsp. xyli were tested and performed in three steps: pure bacteria, bacteria inoculated directly in the extract from five different varieties of sugarcane, and extract from a stem knowingly infected with these bacteria. The results indicate that the amplifications occur more frequently when the products and repeatability of the extractions are diluted by 10-4 in the Leaf Scald. Without this diluition steps, the amplification does not occur, even with the method of DNA extraction considered as a standard. Thus, it is concluded that the detection does not happen if the DNA extraction product is not diluted at least 1000 times, which should prevent the action of inhibitory factors that can hinder the PCR reactions. As for the ratoon stunting disease additional studies are needed to enable its detection by PCR