Cloning and expression of the thioredoxin 1 gene of Paracoccidioides brasiliensis in pichia pastoris

O fungo termodimórfico Paracoccidioides brasiliensis é agente etiológico da paracoccidioidomicose, uma micose sistêmica humana, com alta prevalência na América Latina. P. brasiliensis está sujeito a estresse oxidativo (EO) causado pelas espécies reativas de oxigênio (EROs), produzidas pelas células de defesa do hospedeiro humano. O sistema de defesa do hospedeiro quando da invasão por patógenos gera EROs para combater este invasor. P. brasiliensis ao penetrar no hospedeiro humano é fagocitado pelos macrófagos, enfrentando um ambiente extremamente hostil devido ao oxido nítrico e peróxido de hidrogênio. A Trx1 é uma proteína redox, intracelular, que participa da manutenção da homeostase redox da célula, tanto em condições de EO quanto redutor. É ubiquitária e caracterizada pelo sítio ativo típico CXXC, responsável pela oxidação, redução, ou isomerização das pontes dissulfeto de proteínas. Em trabalho realizado anteriormente, foi isolado, caracterizado e clonado em vetor de expressão pGEX4T-3 o cDNA codificante para Trx1 de P. brasiliensis (número de acesso AY376435). A proteína recombinante (recPbTRX1) foi produzida e parcialmente purificada e as células leveduriformes de P. brasiliensis apresentaram expressão aumentada do gene codificante para Pbtrx1 em condições de EO. O presente trabalho teve como objetivo a expressão heteróloga de uma tiorredoxina do fungo P. brasiliensis em Pichia pastoris, visando sua obtenção em maior quantidade para sua a posterior caracterização bioquímica e aplicação em processos biotecnológicos. O cDNA do gene da tiorredoxina 1 (trx1) de P. brasiliensis foi obtido via PCR utilizando como molde o plasmídeo pGEX-Trx1 e clonado no vetor de expressão pHIL-D2 e pPIC9 (para expressão intracelular e extracelular). A inserção do gene de interesse na orientação correta foi verificada por seqüenciamento, apresentando homologia com a Trx1 de P. brasiliensis. Estes vetores foram utilizados para transformar a linhagem SMD1168 da levedura P. pastoris com genótipo his4-. A presença do cassete de expressão foi confirmada no genoma da levedura. Não foram detectados transformantes capazes de secretar a proteína a partir da construção com o vetor pPIC9 e a produção intracelular foi realizada a partir do vetor pHIL-D2.The termodimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis is the etiological agent of paracoccidioidomycosis, a human systemic mycosis of high prevalence in Latin America. P. brasiliensis is exposed to oxidative stress (OS) caused by reactive oxygen species (ROS) produced by the defense cells of the human host. When the invasion by pathogens occurs, the host defense system generates ROS to fight the invader. Inside the human host, P. brasiliensis is phagocytosed by macrophages, facing an extremely hostile environment due to nitric oxide and hydrogen peroxide. The Trx1 is an intracellular redox protein, which participates in the maintenance of cell redox homeostasis, both in terms of OS as reducer. It is ubiquitous and is characterized by typical CXXC active site, responsible for oxidation, reduction, or isomerization of proteins disulfide bonds. In a previous work, it was isolated, characterized and cloned into expression vector pGEX-4T-3 cDNA coding for TRX1 of P. brasiliensis (accession number AY376435). The recombinant protein (recPbTRX1) was produced and partially purified and the yeast cells of P. brasiliensis showed increased expression of the gene coding for PbTRX1 in response to OS. This study aimed the heterologous expression of cDNA of a thioredoxin of the fungus P. brasiliensis in Pichia pastoris, in order to obtain it in larger amounts for their subsequent biochemical characterization and application in biotechnological processes. The P. brasiliensis thioredoxin 1 (trx1) cDNA was obtained via PCR using the plasmid pGEX-Trx1 as template and cloned into expression vector pHIL-D2 and pPIC9 (for intracellular and extracellular expression). The insertion of the interested gene in the correct orientation was verified by sequencing and the homology was observed with Trx1 P. brasiliensis. These vectors were used to transform the P. pastoris yeast strain SMD1168 with his4- genotype. The presence of the cassette s expression was confirmed in the yeast s genome. No transformants able to secrete the protein from the building with the vector pPIC9 were detected and the intracellular production was carried from the pHIL-D2 vector