Neospora caninum: diagnosis and genetic characterization in fetuses of zebu cows slaughtered

Uma das principais causas mundiais de falhas reprodutivas em bovinos é a infecção pelo protozoário Neospora caninum (Filo Apicomplexa, Família Sarcocystidae). A neosporose bovina é caracterizada por infecção assintomática na fêmea não prenhe, no entanto, durante a gestação, a transmissão vertical do parasito é a responsável pela manutenção da infecção por gerações sucessivas. A maior freqüência da infecção ocorre no sistema de produção leiteiro e no manejo intensivo de criação dos animais, sendo a maioria dos dados disponíveis para N. caninum referentes a Bos taurus, mesmo para gado de corte. Assim, a presença de N. caninum tem sido pouco estudada em Bos indicus. Em Goiás, a prevalência de N. caninum é de 29,61% em gado de corte e 30,4% em leite. Como a prevalência da infecção em adultos deve ter correlação positiva com a incidência da infecção fetal, objetivou-se avaliar a ocorrência da transmissão vertical de N. caninum em fetos zebuínos de variadas idades, obtidos de fêmeas abatidas em um frigorífico no município de Senador Canedo, Goiás. Para tanto, realizaram-se análise sorológica em líquidos toráco-abdominais e análises molecular e histopatológica em amostras teciduais (cérebro, coração e fígado). A idade fetal foi determinada a partir da distância entre a região occipital e a base da cauda. Um total de 195 líquidos fetais foi colhido aleatoriamente e testado por RIFI com um ponto de corte de 1:16. Foram submetidas 585 amostras de tecidos à análise pela nested-PCR da região ITS-1 rRNA e à histopatologia. Os resultados encontrados foram relacionados com a idade fetal (primeiro, segundo e terceiro estágios gestacionais). Anticorpos anti-N. caninum foram detectados em 12 (6,15%) líquidos fetais, com titulação observada a 1:64 (n=1), 1:128 (n=2), 1:512 (n=3), 1:1024 (n=5) e 1:2048 (n=1). Foi detectada a presença do parasito por PCR em 40 (20,5%) fetos. No exame histopatológico, 82 (42,05%) fetos apresentaram lesões características e consistentes com infecção por protozoário, caracterizadas por encefalite, miocardite e hepatite com infiltrado mononuclear, com ou sem necrose. Na comparação entre as diferentes idades gestacionais, observaram-se maior número de reações positivas por RIFI, PCR e lesões compatíveis por histopatológico, no sexto e sétimo mês de gestação. Do total das 585 amostras de tecidos examinadas, 56 foram positivas, sendo 12 na sorologia e 44 (35 cérebros, sete corações e dois fígados) na PCR, provenientes de 45 fetos. No histopatológico, 10 amostras (três cérebros, seis corações e um fígado) apresentaram lesões características de infecção por protozoários como o N. caninum. O DNA de seis fetos PCR positivos foi submetido à análise por marcadores microssatélites para a caracterização genética dos isolados de N. caninum presentes, demonstrando a existência de perfis genéticos diferentes de outros isolados do mundo e do Brasil infectando zebuínos. Os resultados obtidos comprovam a ocorrência da transmissão vertical de N. caninum, o diagnóstico da infecção em fetos zebuínos, a necessidade de associação de técnicas para a determinação da neosporose fetal e a caracterização de diferentes isolados regionais circulantes no rebanho zebuíno de Goiás.One of the main causes of reproductive failure in cattle is infection by the protozoan Neospora caninum (Phylum Apicomplexa, Family Sarcocystidae). The bovine neosporosis is characterized by an asymptomatic infection in the non pregnant cow; however, during pregnancy, the vertical transmission of the parasite is responsible for the maintenance of the infection for successive generations. The highest frequency of infection occurs in the dairy production system and in the intensive management of animal breeding, with most of the available data for N. caninum related to Bos taurus, even for beef cattle. Thus, the presence of N. caninum has been little studied in Bos indicus. In Goiás, the prevalence of N. caninum is 29.61% in beef cattle and 30.4% in dairy cattle. As the prevalence of infection in adults should have a positive correlation to the incidence of fetal infection, this study aimed to evaluate the occurrence of vertical transmission of N. caninum in zebuine fetuses of various ages, obtained from females slaughtered in a slaughterhouse in the municipality of Senador Canedo, Goiás. For that, the serological analysis of abdominal fluid and molecular and histopathological analysis in tissue samples (brain, heart and liver) were performed. The fetal age was estimated by the measurement of crown-rump length. A total of 195 fetal fluids was randomly collected and tested by IFAT with a cut-off point of 1:16. 585 tissue samples were submitted to nested-PCR analysis of ITS-1 rRNA region and to histopathology. The results were related to the fetal age (first, second and third stages of pregnancy). Anti-N. caninum antibodies were detected in 12 (6.15%) fetal fluids, with IFAT titers observed at 1:64 (n=1), 1:128 (n=2), 1:512 (n=3), 1:1024 (n=5) and 1:2048 (n=1). The presence of the parasite was detected by PCR in 40 (20.5%) fetuses. On histopathological examination, 82 (42.05%) fetuses had characteristic and consistent lesions, compatible with protozoan infection, characterized by encephalitis, myocarditis and hepatitis with mononuclear cell infiltrates, with or without necrosis. Comparing the different gestational ages, there was a greater number of positive reactions by IFAT, PCR and compatible histopathological lesions in the sixth and seventh month of pregnancy. From the total of 585 tissue samples examined, 56 were positive, being 12 at serology and 44 (35 brains, seven hearts and two livers) at PCR from 45 fetuses. In histopathology, 10 samples (three brains, six hearts and one liver) showed characteristic lesions of protozoan infection such as N. caninum. The DNA from six PCR positive fetuses was analyzed by microsatellite markers for genetic characterization of isolates of N. caninum, demonstrating the existence of genetic profiles different from other isolates of the world and of Brazil infecting zebuine animals. The results confirm the occurrence of vertical transmission of N. caninum, the diagnosis of infection in zebuine fetuses, the need of association of techniques for determining fetal neosporosis and characterization of different regional isolates circulating in zebu herd from Goiás