Evaluation of different cryoprotectant and Forskolin in the culture medium for improving the efficacy of vitrification of Bos indicus in vitro derived embryos

Os embriões bovinos de raças zebuínas produzidos in vitro (PIV) são mais sensíveis ao congelamento, devido, em parte, ao acúmulo de gotas lipídicas no citoplasma das células embrionárias. A criopreservação de embriões é um passo fundamental para a aplicação prática de outras técnicas de embriologia nos animais domésticos. Além disso, o sucesso da criopreservação de embriões Nelore PIV é fundamental para o desenvolvimento da comercialização de material genético nos mercados interno e externo. Neste trabalho, foram conduzidos dois experimentos: no primeiro, o objetivo foi avaliar a taxa de eclosão de embriões bovinos da raça Nelore PIV vitrificados no estágio de blastocisto expandido (Bx) empregando a metodologia CRYOTOP com o uso das soluções Etileno Glicol (EG) + Dimetil Sulfóxido (DMSO) e EG + 1,2 Propanediol (PRO). No segundo experimento, objetivou-se determinar a taxa de eclosão de embriões bovinos da raça Nelore PIV cultivados ou não em meio contendo 10 &#956;M do agente lipolítico forskolin, vitrificados no estágio de BX. No experimento 1, a taxa de eclosão dos embriões do grupo não vitrificado (G3) foi de 86,4%, superior (P<0,05) aos grupos vitrificados, os quais apresentaram taxas de eclosão de 77,1% e 72,9% nos grupos G1 (EG+PRO) e G2 (EG+DMSO), respectivamente. No experimento 2 observou-se maior viabilidade (P<0,05) do G3-F (grupo não vitrificado; 85,4%) em relação ao G1-F (cultivo com SOF controle; 63,3%) e ao G2-F (cultivo com forskolin; 70,5%). Entre os grupos vitrificados, os embriões cultivados com forskolin obtiveram taxa de eclosão superior ao grupo não tratado (P<0,05). Sendo assim, conclui-se que as soluções de EG+PRO e EG+DMSO apresentaram resultados semelhantes na vitrificação de embriões PIV de bovinos e o uso do agente lipolítico forskolin no cultivo de embriões PIV de bovinos da raça Nelore pode melhorar a criotolerância dos embriões.Considering the in vitro method of embryo production, field results have shown a lower resistance to cryopreservation for B. indicus, when compared to B. taurus embryos. A possible explanation for this is a great concentration of lipid droplets in the cytoplasm of cells from B. indicus embryos. The objective of this study was to compare two cryoprotectants (Propanediol and DMSO) to vitrification and evaluate the effect of adding 10&#956;M Forskolin to the SOF medium for embryo culture prior to cryopreservation. For all the experiments, ovaries from slaughtered Nelore Bos indicus donors were recovered and maintained at 30-35°C in NaCl solution until recovery of the cumulus-oocyte complexes. Embryos submmited to vitrification were expanded blastocysts at day seven of in vitro culture. In the first experiment embryos were first incubated in 10% Ethylene Glycol (EG) plus 10% DMSO dissolved in holding medium (TCM-Hepes with 20% calf serum) for 1 min and then transferred to droplet of 20% EG plus 20% DMSO in holding medium and 0.5M sucrose for 20 seconds before immersing in liquid nitrogen (n = 107; group EG+DMSO). For the group EG+Propanediol (EG+PRO; n = 96) blastocysts were placed in 10% EG plus 10% PRO in holding medium for 1 min, and then transferred to a droplet of 20% EG plus 20% PRO in holding medium and 0.5M sucrose for 20 seconds before immersing in liquid nitrogen. Both treatments were performed using the Cryotop system. Results were compared with embryos (n = 118) not submitted to cryopreservation. The evaluation was done by the hatching rate of blastocysts at Day 9, being higher (86.4%) for embryos not cryopreserved, when comparing to 77.1% for group EG+PRO and 72.9% for group EG+DMSO (P<0.05). In the second experiment, day 5 embryos obtained in vitro from Nelore donors were cultured using SOF medium with 10&#956;M Forskolin (n = 112) or not (control; n = 101), being all submitted to cryopreservation using Cryotop and the same vitrification method for group EG+DMSO. Results were compared with embryos cultured with SOF medium and not submitted to cryopreservation (n = 96). The evaluation was performed by considering hatching rate at Day 9, being higher - 85.4% - for not cryopreserved, when compared with 63.3% for control and 70.5% for Forskolin group (P<0.05). Considering embryos submitted to cryopreservation, the hatching rate was higher (P