Molecular diagnostics of Ehrlichia canis in dogs from Goiânia state of Goiás, Brazil

v.42,n.1,p.30-41,jan./mar. 2013.Ehrlichia canis é um parasito bacteriano intracelular obrigatório, agente da Erliquiose Monocítica Canina. O método de diagnóstico laboratorial de rotina é realizado pela demonstração microscópica direta das inclusões intraleucocitárias. Mais recentemente a reação em cadeia da polimerase (PCR) foi introduzida como um método para aumentar a sensibilidade e a especificidade do diagnóstico. O objetivo deste trabalho foi pesquisar a presença de Ehrlichia em cães na cidade de Goiânia, Goiás, por métodos de diagnóstico molecular. Para o estudo, foram obtidas 40 amostras de sangue de cães sintomáticos atendidos no Hospital Veterinário da Universidade Federal de Goiás. Todas as amostras, após a extração de DNA, foram testadas pela PCR empregando-se oligonucleotídeos gênero-específicos e, posteriormente, espécie-específicos para o gene 16S rRNA. Em seguida, foi realizada a purificação do produto de PCR espécie-específico para a realização de sequenciamento. Destas, 17 mostraram-se PCR positivas tanto nas reações para gênero quanto para a espécie E. canis. Os produtos de PCR foram sequenciados e as sequências com melhor qualidade (n=5) foram escolhidas para estudos subsequentes. A análise de similaridade pelo BLASTn demonstrou correspondência com a espécie Ehrlichia canis. Graças à utilização do programa Mega4 foi possível verificar que as amostras de E. canis provenientes de cães da cidade de Goiânia apresentam elevado grau de similaridade molecular com os isolados de referência para a mesma subespécie de outras regiões do Brasil e do mundo. Amostras de E. canis de cães avaliados neste estudo formam grupo filogenético bem definido, juntamente com amostras de referência de E. canis de diferentes regiões geográficas. As sequências obtidas foram depositadas no GenBank como sequências parciais do gene 16S rRNA de E. canis, procedentes de Goiânia. _______________________________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT _______________________________________________________________________________________________________________________ The obligate intracellular bacterial parasite known as Ehlichia canis is the etiological agent of the Canine Monocytic Erhlichiosis. The most frequent applied method for routine laboratory diagnosis is based on the microscopic direct detection of intraleucocytic inclusions. More recently the polymerase chain reaction (PCR) has been introduced to improve mainly the sensitivity and specificity of diagnosis. The objective of this study was to investigate the presence of Ehrlichia in dogs from the city of Goiânia, Goiás by molecular techniques. Blood samples were collected from 40 symptomatic dogs referred to the Veterinary Hospital of the Federal University of Goiás. All samples were processed for DNA extraction and PCR using both genus and species-specific oligonucleotides for the 16S rRNA gene. PCR reactions resulted positive for both genus and species assays for 17 out of 40 tested samples. The species-specific PCR products of the 17 samples were purified and sequenced but only five of these were considered for subsequently molecular studies due to the quality analysis results of the sequences. These five sequences were then analyzed for similarity by BLASTn algorithm in which they could be identified as Ehrlichia canis. Using Mega4 software it was confirmed that these isolates of E. canis from dogs of Goiânia are highly similar to other reference isolates of the same species from other regions of Brazil and worldwide. The isolates of E. canis evaluated in this study are phylogenetically similar to those reference isolates from other geographic regions of the world. Sequencies were deposited in the GenBank as E. canis 16S rRNA parcial sequencies from Goiâni