Interação do Coffee ringspot virus (CoRSV) com a célula hospedeira empregando proteínas fluorescentes

O vírus da mancha anular do cafeeiro (Coffee ringspot virus - CoRSV) está amplamente disseminado em todas as principais regiões produtoras do Brasil. Esse vírus, além de causar intensa desfolha e queda de frutos, também, deprecia a qualidade da bebida. O seu genoma, recentemente sequenciado, é composto por dois RNAs de polaridade negativa. O RNA 1 codifica cinco proteínas: nucleocapsídio (N), fosfoproteína (P), proteína do movimento (3), proteína matriz (M) e glicoproteína (G). O RNA 2 apenas uma grande proteína, a RNA dependente da RNA polimerase (L). Para o completo entendimento dos mecanismos moleculares que envolvem os processos da infecção viral e a correta classificação das proteínas codificadas pelo vírus, é indispensável o estudo da interação das proteínas virais com a célula hospedeira e a construção dos mapas de localização dessas proteínas no ambiente celular. Neste trabalho, as cinco proteínas codificadas pelo RNA 1 foram fusionadas às proteínas fluorescentes GFP e RFP, clonadas no plasmídeo pSITE e expressadas via Agrobacterium tumefaciens em plantas transgênicas de Nicotiana benthamiana, contendo genes codificadores de marcadores nucleares e do retículo endoplasmático, fusionados com o GFP, RFP e/ou CFP. Informações complementares sobre a interação entre as proteínas do CoRSV e a localização dessa interação no ambiente celular foram, também, obtidas por meio da técnica BiFC (Bimolecular fluorecence complementation). Em análise ao microscópio confocal, verificou-se que a proteína N se localiza no núcleo e no citoplasma das plantas infiltradas, a proteína P apenas no núcleo, a proteína 3 na periferia das células, a proteína M no núcleo e no citoplasma, enquanto a proteína G foi detectada no envelope nuclear e nas membranas perinucleares das células de N. benthamiana. Quando coexpressas, as proteínas N e P se interagiram e a proteína N foi capaz de redirecionar a proteína P do núcleo para o citoplasma. Os experimentos de interação entre as proteínas do CoRSV foram positivos para P/P, P/M e N/P no núcleo e N/M e G/G na periferia nuclear. Não foram detectadas interações entre as demais proteínas estudadas. Pelos resultados desse experimento confirmaram-se aqueles obtidos na análise computacional realizada com as sequências genômicas do CoRSV.Tese apresentada à Universidade Federal de Lavras, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Agronomia, área de concentração Fitopatologia, para a obtenção do título de Doutor