Interação de proteínas Cry1A com as vesículas da borda escovada da membrana (BBMVs) do intestino médio de Spodoptera frugiperda e Diatraea saccharalis e avaliação do tempo de cultivo sobre a produção de β-exotoxina em isolados de Bacillus thuringiensis

Bacillus thuringiensis é uma bactéria entomopatogênica capaz de sintetizar diferentes toxinas, tais como δ-endotoxinas com atividade tóxica específica para insetos e β-exotoxina. Esta bactéria é amplamente utilizada no controle biológico de pragas e em várias cultivares geneticamente modificadas através da expressão dos genes das δ-endotoxinas que permitem as plantas tornarem-se tolerantes ao ataque de insetos. Com isto vários eventos de milho transgênicos vêm sendo desenvolvidos, visando o controle de insetos-pragas como Spodoptera frugiperda e Diatraea saccharalis, consideradas importantes pragas desta cultura. Este estudo teve por objetivo analisar a interação das proteínas inseticidas Cry1Aa, Cry1Ab e Cry1Ac com os sítios de ligação do intestino médio de lagartas de S. frugiperda e D. saccharalis e detectar a síntese de β-exotoxina em cepas de B. thuringiensis com potencial de serem utilizadas na formulação de biopestida e avaliar o efeito do tempo de cultivo sobre a produção desta toxina. Para o primeiro trabalho as proteínas Cry1Aa, Cry1Ab e Cry1Ac expressas separadamente em cepas recombinantes de B. thuringiensis foram extraídas, solubilizadas, tripsinadas e marcadas com biotina. As preparações de BBMVs foram extraídas a partir do intestino médio retirado de lagartas do terceiro estádio. Para realizar os estudos de ligação e competição foram realizadas incubações com a toxina biotinilada e preparações de BBMVs na ausência ou presença de um competidor. Os resultados demonstraram que todas proteínas testadas são capazes de se ligar aos receptores do intestino médio das lagartas de S. frugiperda e D. saccharalis. Não foi verificado competição entre as proteínas pelos receptores de ambas pragas, exceto as proteínas Cry1Aa e Cry1Ac que compartilham o mesmo receptor em D. saccharalis. Também foi observado que possivelmente haja sinergismo entre Cry1Ab e Cry1Ac em S. frugiperda. Para o segundo trabalho, o sobrenadante foi coletado de cepas de B. thuringiensis cultivadas durante 48, 72, 96, 120 e 144 horas, autoclavado, filtrado e testado contra lagartas de S. frugiperda através de bioensaios. A análise de 30 cepas de B. thuringiensis demonstrou que 4 cepas (13,3%) apresentaram sobrenadantes tóxicos para S. frugiperda e portando produzem β-exotoxina. Nas cepas que foram positivas para a presença de β- 10 exotoxina incluindo os controles positivos, foi verificado que o tempo de cultivo exerce influência sobre a produção deste metabólito além disso o tempo de cultivo no qual é detectada a síntese da toxina é dependente da cepa visto que foi observado um pico de produção de β-exotoxina a partir de 48, 96 e 144 horas de cultivo, de acordo com os valores da mortalidade e peso médio apresentados pelas lagartas de S. frugiperda nestes tempos de cultivo.Dissertação apresentada à Universidade Federal de Lavras, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Vegetal, área de concentração em Biologia Molecular, para a obtenção do título de Mestre