USEFULNESS OF A CHROMATOGRAPHY SIMULATION SOFTWARE ON THE REVERSED-PHASE SEPARATION OF FLAVONOIDS BY HPLC-DAD

A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) permite análises químicas qualitativas e quantitativas, separando e identificando substâncias em misturas com rapidez e eficiência. Entretanto, os fatores que governam a retenção cromatográfica são complexos e a fase de desenvolvimento de métodos consome muitos recursos. Em nosso trabalho nós avaliamos um pacote de softwares de simulação cromatográfica (HIPAC-G, HIPAC-B e HIPAC-S, Phenomenex, Torrance, USA) para otimização da separação cromatográfica de oito padrões de flavonóides: (3-O-[β-D-glicopiranosil-(1→6)-α-L-ramnopiranosil]-7-O-α-Lramnopiranosilkanferol; hesperidina; kanferol; tilirosideo; quercetina; 3,4 ,7,8-tetra-O-metilgossipetina; 3,3 ,4 ,7,8-penta-O-metil-gossipetina; 3,3 ,4 ,7-tetra-O-metil-quercetina). O modelo de retenção do HIPAC se baseia na conhecida relação linear entre o fator de retenção de um analito e a porcentagem de solvente orgânico na fase móvel para simulação de dados de retenção. Utilizando eluição em modo gradiente, três corridas preliminares foram realizadas (corridas preliminares são usadas para inserir dados de retenção para o software). A primeira corrida preliminar usou uma coluna C18 (250 x 4,6 mm, 5 m) e como fase móvel um gradiente de 5 a 95% de acetonitrila (solvente B) e acido fórmico a 0,1% (solvente A) a um fluxo de 1 mL/min com detecção no ultravioleta a 264 nm. A primeira corrida preliminar foi composta de duas corridas em modo gradiente usando as mesmas condições cromatográficas, mas com diferentes durações de tempo de gradiente (30 e 60 minutos respectivamente). A segunda corrida preliminar utilizou as mesmas condições cromatográficas da primeira, mas como modificador orgânico usou metanol ao invés de acetonitrila e %B inicial e final de 10% e 100%, respectivamente. A terceira corrida preliminar foi feita com as mesmas condições cromatográficas da segunda corrida, mas utilizando uma coluna com fase estacionária e dimensões diferentes (C8, 150 x 4,6 mm, 5 m). Os dados de retenção das três corridas preliminares foram usados para alimentar o software de simulação, utilizando o módulo HIPAC-G. Para simulação em modo isocrático usou-se o módulo HIPAC-B, tanto com uma coluna C8 (150 x 4,6 mm, 5 m) quanto C18 (250 x 4,6 mm 5 m) e misturas binárias de MeOH (Solvente B) em 0,1% de ácido fórmico (Solvente A). Duas corridas preliminares com 60% e 70%B foram realizadas para cada coluna e os dados de retenção resultantes foram usados para alimentar a simulação. As condições otimizadas de separação sugeridas pelo HIPAC-B foram usadas como dados para inserção no HIPAC-S para otimizar as condições do sistema cromatográfico. O critério de otimização utilizado para todas as simulações foi a resolução média global para todos os picos no cromatograma. No total, doze simulações em modo gradiente e quatro simulações em modo isocrático foram realizadas. Os dados de retenção simulados foram comparados com os dados experimentalmente obtidos para os oito flavonóides padrões. O coeficiente de correlação (r2) entre os tempos simulados e observados para analitos eluídos em modo gradiente variaram de 0,9416 a 0,9992 (n=12). O coeficiente de correlação em modo isocrático variou de 0.9999 a 1 (n=4), indicando excelente eficiência em predizer dados de retenção para a mistura testada. Tomados em conjunto, nossos resultados mostram que o uso de softwares de simulação cromatográfica tal como HIPAC-G, HIPAC-B e HIPAC-S podem constituir uma importante ferramenta na otimização das condições de separação de misturas complexas, tais como as que são encontradas no campo de produtos naturais.High Performance Liquid Chromatography (HPLC) allows both qualitative and quantitative chemical analysis, separating and identifying substances in mixtures with speed and efficiency. However, factors governing chromatographic retention are complex and the method development phase consumes a lot of resources. In our work we evaluated a chromatographic simulation software package (HIPAC-G, HIPAC-B e HIPAC-S, Phenomenex, Torrance, USA) for optimizing the chromatographic separation of eight flavonoid standards (3-O-[β-Dglucopyranosyl-( 1→6)-α-L-ramnopyranosyl]-7-O-α-L-ramnopyranosyl kampferol; hesperidine; kampferol; tiliroside; quercetin; 3,4 ,7,8-tetra-O-methyl-gossypetine; 3,3 ,4 ,7,8-penta-O-methylgossypetine and 3,3 ,4 ,7-tetra-O-methyl-quercetin). The HIPAC model of retention is based on the known linear relationship that exists between the retention factor of an analyte and the percentage of organic solvent in the mobile phase, to simulate retention data. Using gradient elution, three trial runs were done (preliminary runs that are used to input retention data to the software). The first trial run used a C18 column (250 x 4,6 mm, 5 m) and as mobile phase a gradient from 5 to 95% of acetonitrile (solvent B) in 0,1% formic acid (solvent A) at a flow rate of 1 mL/min with UV detection at 264 nm. The first trial run was comprised of two gradient runs using the same chromatographic conditions but different gradient duration times (30 and 60 minutes respectively). The second trial run used the same chromatographic conditions as the first one, but methanol instead of acetonitrile as the organic modifier and 10% and 100% as the initial and final %B, respectively. The third trial run was done with the same chromatographic conditions as the second one, but using a column with different stationary phase and dimensions (C8, 150 x 4,6 mm, 5 m). The retention data of the three trial runs were used as input to the simulation software, using the HIPAC-G module. For isocratic mode simulation using the HIPAC-B module, both a C8 (150 x 4,6 mm, 5 m) and a C18 (250 x 4,6 mm 5 m) column was used with binary mixtures of MeOH (solvent B) in 0,1% formic acid (solvent A). Two trial runs with 60% and 70%B were done for each column and the resulting retention data used as input for simulation. The optimized separation conditions as suggested by HIPAC-B were used as input for HIPAC-S to optimize the system chromatographic conditions. The optimization criterion used for all simulations was the average global resolution for all peaks in the chromatogram. Altogether twelve simulations in gradient elution mode and four isocratic simulations were done. The simulated retention data was then confronted with experimentally obtained retention data for the eight flavonoid standards. The correlation coefficient (r2) between simulated and observed retention times for the analytes when eluted in gradient mode varied from 0,9416 to 0,9992 (n=12). The correlation coefficient in isocratic mode varied from 0.9999 to 1 (n=4), indicating an excellent efficiency in predicting retention data for the mixture tested. Taken together our results show that the use of chromatographic simulation software such as HIPAC-G, HIPAC-B e HIPACS can constitute an important tool in the optimization of separation conditions of complex mixtures, such as those found in the field of natural products