Desenvolvimento e validade de um método de determinação do número de cópias transgenes no genoma da soja por PCR quantitativo

As ferramentas de biotecnologia têm proporcionado nos dias atuais o desenvolvimento de organismos geneticamente modificados (OGMs), sejam microorganismos, plantas ou animais. Plantas geneticamente modificadas (PGM) possibilitam a solução de problemas na produção, agregando valor aos produtos agrícolas e em várias situações, oferecendo alternativas importantes para a melhoria na qualidade de vida humana e do ambiente. Após a obtenção de plantas GM, a caracterização molecular dos eventos constitui uma etapa essencial para a identificação das linhagens mais promissoras, que venham constituir o evento GM elite, a ser utilizado como linhagem parental no programa de melhoramento. A caracterização molecular quanto ao número de cópias do transgene, bem como do sítio de inserção, permite inferir sobre a estabilidade do genoma receptor após a transformação gênica. Este trabalho teve como principal objetivo avaliar a eficácia da quantificação do número de cópias transgenes no genoma da soja utilizando a metodologia de PCR quantitativo (qPCR) comparando-a à técnica pioneira de Southern blotting. Foram testados 2 sistemas de quantificação por qPCR por quantificação relativa, baseados em DNA genômico, um que empregou a fórmula 2-∆∆Ct , utilizando uma amostra com número de cópias do transgene conhecida como calibradora; e outro, que utilizou a própria referência endógena como calibrador, através da fórmula 2-∆Ct/2. Além destes, plasmídeos recombinantes, contendo as regiões de interesse (transgene) e parte do gene da lectina clonados, foram utilizados para a construção de curvas de calibração para determinação do número absoluto de cópias do transgene no genoma da soja. Para determinação da exatidão dos diferentes sistemas os resultados foram comparados com os obtidos através da técnica de Southern blot. Nove eventos GM contendo o gene DREB1A tiveram o número de cópias dos cassetes transgenes quantificados via qPCR por quantificação relativa. De acordo com os resultados, 9 eventos tiveram o número de cópias dos cassetes determinados pelas duas metodologias de qPCR por quantificação e confirmados por Southern blot. Os resultados demonstraram que ambos os métodos de quantificação relativa possibilitaram a quantificação exata do número de cópias do transgene no genoma das amostras testadas. O emprego da própria referência endógena como calibradora foi mais precisa, uma vez que elimina variações na amplificação que possam ocorrer entre amostra/calibrador. Tais resultados indicam a potencialidade, além da praticidade e rapidez, do emprego da técnica de qPCR para realizar o screening inicial de plantas GM na seleção de eventos com baixo número de cópias, e, conseqüentemente, na aceleração do desenvolvimento de eventos GM elites.Biotechnology has allowed the development of genetically modified organisms (GMOs) permitting the solution of many production problems aggregating values to agriculture products and offering, in many situations, important alternatives in human life and environment quality. After obtain a GM plant, events molecular characterization is an essential step to identity more promising lines, which is the GM elite event, to be used as parental line in a breeding program. Molecular characterization of number of transgene copies and also insertion site allows inferring the stability of receptor genome after genetic transformation process. This work had as principal objective to develop and to evaluate the efficiency on quantification of transgene cassettes insertion in soybean genome and the number of copies utilizing the quantitative PCR methodology compared to a pioneer technique Southern blotting. Two systems were tested to quantify the number of copies by quantitative PCR, one based in genomic DNA, which used the relative quantification by the 2-ΔΔCt formula and other using the endogenous reference as calibrator. Recombinant plasmids, containing the interested region (transgene) and part of lectin gene, which was used as endogenous reference, were cloned to construct calibration curves to determine the absolute number of copies of the transgene in soybean genome together with genomic DNA. To determine the precision of the different systems, results obtained were compared to the Southern blotting technique. Nine GM events containing the DREB1A gene had the number of transgene copies quantified, using PCR QT by relative quantification. According to the results nine events had the number of cassettes determinate by two methodologies of PCR QT and confirmed by Sothern blotting. Results demonstrated that both relative quantification methods allowed to exact quantification of transgene copy number in the genome of the tested samples. The use of the endogenous reference as calibrator sample was more precise, once variations on sample/calibrator amplification are eliminated. These results indicates the potential besides the practical and fastness of qPCR technique to make the initial screening of GM plants for selection of events with lower copy numbers and consequently the acceleration of development of GM elite events