Taxonomia e filogenia de microssimbiontes de feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) com o uso da metodologia de MLSA (multilocus sequence analysis)

Os rizóbios são bactérias que vivem em simbiose com algumas leguminosas. Atualmente, a filogenia dos rizóbios, assim como de outros procariotos é baseada, principalmente, no gene ribossomal 16S, embora alguns estudos tenham demonstrado que os genes ribossomais podem, ocasionalmente, sofrer transferência lateral e recombinação genética, fazendo com que os resultados nem sempre possam refletir a verdadeira filogenia procariótica. Com o objetivo de minimizar esses efeitos foi proposta a técnica de MLSA (Multilocus Sequence Analysis), que utiliza mais que um locus gênico, resultando em uma análise mais precisa. Neste estudo, foram utilizadas 18 estirpes de rizóbios microssimbiontes do feijoeiro, com o objetivo de correlacioná-las taxonomicamente e filogeneticamente, através da técnica de MLSA, utilizando cinco genes conservados e essenciais ao metabolismo microbiano (genes houseekeping) além do gene ribossomal 16S. As espécies de rizóbios descritas como simbiontes de feijão formaram grupos separados, tanto nas análises dos genes separadamente como na análise dos genes concatenados . As similaridades das sequências dos genes entre as cinco espécies tipo variaram de 95 a 100% para o gene ribossomal 16S e de 83 a 99% para os outros 5 genes. Os cinco genes podem assim ser utilizados como marcadores para o gênero Rhizobium, e com isso auxiliarão na identificação de rizóbios que venham a ser isolados. O MLSA também revelou uma grande diversidade genética entre as estirpes classificadas como R. tropici, demonstrando a evidência de novas espécies.The diazotrophic bacteria that are collectively known as “rhizobia” are important for establishing symbiotic N2-fixing associations with many legumes. These microbes have been used for over a century as an environmentally beneficial and cost-effective means of ensuring acceptable yields of agricultural legumes. The most widely used phylogenetic marker for identification and classification of rhizobia has been the 16S rRNA gene; however, this marker fails to discriminate some closely related species. In this study we have established the first multilocus sequence analysis (MLSA) scheme for the identification and classification of rhizobial microsymbionts of common bean (Phaseolus vulgaris L.). We have analyzed eighteen strains, including type strains and representatives of the biodiversity present in Brazilian soils, by means of sequencing recA, dnaK, gltA, glnII and rpoA genes. Gene sequence similarities among the five type strains ranged from 95 to 100% for the 16S rRNA, and from 83 to 99% for the other five genes. Rhizobial species described as symbionts of common bean have also formed separated groups on the analysis of single and concatenated gene sequences, and clusters formed in each tree were 39 in good mutual agreement. The five additional loci may thus be considered as useful markers for the genus Rhizobium, and will allow underpinning the online identification of rhizobial isolates. The MLSA also revealed broad genetic diversity among strains classified as R. tropici, providing evidence of new species