Avaliação molecular parcial do gene da hemaglutinina do vírus da cinomose canina

Urina e leucócitos de 56 cães com diagnóstico clínico de cinomose foram avaliados comparativamente pela técnica de Transcrição Reversa seguida de Reação em Cadeia pela Polimerase (RT-PCR) para o gene da hemaglutinina (Gene H) do vírus da cinomose canina, urina e leucócitos de 56 cães com diagnóstico clínico de cinomose. De acordo com a predominância dos sinais clínicos os cães foram distribuídos em três grupos (17=sistêmicos; 8=neurológicos e 31=sistêmicos e neurológicos). A amplificação do segmento de 721 pares de base foi possível em 45/56 cães. Em 34/45 cães o CDV foi detectado tanto em urina e quanto em leucócito. Em 11/45 cães somente um tipo de material biológico foi positivo (urina 1/45 e leucócito 10/45). A variedade de sinais clínicos da cinomose canina e a escolha do material pode gerar resultados falso negativos, principalmente em cães com sinais clínicos somente sistêmicos, grupo A onde 7/17 animais foram negativos quando comparados com 1/8 do grupo B e 3/31 do grupo C, é aconselhado o uso de no mínimo duas amostras biológicas para detectar o CDV. Em outro estudo 27 cães positivos e 5 cães negativos pela técnica de RT-PCR para o gene da nucleoproteína do CDV (Gene N) foram distribuídos em quatro grupos (A= sinais clínicos sistêmicos; B= sinais clínicos neurológicos 8; sinais clínicos sistêmicos e neurológicos 9 e D= controle 5 cães). Para o ensaio de polimorfismo no tamanho dos fragmentos de restrição as enzimas Hinf I e Rsa I foram selecionadas para determinar o perfil de restrição do produto amplificado de 721 pb do gene H diretamente das amostras biológicas e das estirpes padrão Onderstepoort, Rockborn e Snyder Hill do CDV. Todos os produtos da RT-PCR geraram com a enzima Hinf I dois fragmentos visualizados com 320 e 250 pb. Com a enzima Rsa I todas as amostras de campo geraram dois fragmentos visualizados de 320 e 230 pb. A estirpe Onderstepoort após a digestão com a enzima Rsa I foi cortado em 363 pb e 327 pb. O perfil de restrição das estirpes Rockborn e Snyder Hill foi o mesmo com dois fragmentos de 363 e 358 pb, confirmando a análise computacional. A estirpe Rockborn não apresenta a seqüência do gene H depositada em banco de dados público. Os produtos da RT-PCR e da RFLP foram determinados por eletroforese em gel de agarose corado a 2% com brometo de etídio e os fragmentos de menor peso molecular não puderam ser visualizados. A relação molecular demonstrada pela RFLP sugere que as amostras do CDV circulantes na região norte do Paraná seja diferente das estirpes padrão do CDV e essas diferenças no perfil de restrição podem caracterizar diferenças moleculares.Urine and leucocytes from 56 dogs with canine distemper clinical diagnosis were evaluated by use in reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) to canine distemper virus (CDV) hemagglutinin gene. In accordance with clinical signs the dogs was disposed in tree groups (A/systemic=17; B/neurological=8; C/systemic and neurological=31) the partial amplification from 721 base pare was possible 45 of 56 dogs. In 34 of 56 dogs the CDV was detected such in urine as in leucocytes. In 11 of 45 dogs only one biological sample was positive (urine=1 dog; leucocytes=10 dogs). It is advisable at least two biological sample to detect the CDV. The variability of canine distemper sings and the material choice may be to generate false-negative results principally en dogs with only systemic clinical sings (A group) where in 7 of 17 dogs was negative when compared with 1/8 B group and 3/31 C group, it is advisable at least two biological sample to detect the CDV. In other experiment 27 dogs positive and 5 negative by RT-PCR to CDV nucleoprotein gene were disposed in four groups in accordance with clinical sings (systemic=10 dogs; neurological=8 dogs; systemic and neurological= 9; control=5). To restriction fragment length polymorphism assay (RFLP) the enzymes Hinf I and Rsa I were selected to determine the RFLP pattern from 721 base pare (bp) fragment of haemagglutinin gene was amplified by using directly biological sample and the laboratory CDV strain Onderstepoor, Rockborn and Snyder Hill. Everyone PCR products after digestion with Hinf I were cut in two seeing fragment of 320 and 230 bp. The wild-type CDV PCR products later than digestion with Rsa I were cut into two seeing fragment around 360 and 230 bp that differ from the laboratory CDV strain. The Onderstepoort PCR product after than digest with Rsa I was cut in 363 and 327 bp. The RFLP pattern with Rsa I from Snyder Hill and Rockborn were the same two fragments with 363 and 358 bp. The Rockborn strain don’t have the genome in public database, but the computational analysis using public nucleotide sequence database and this study show the same RFLP pattern for Onderstepoort and Snyder Hill. The PCR and RFLP products were detected by electrophoresis in 2% agarose gels with ethidium bromide staining and the little fragments don’t be seeing. The molecular relationships showed in RFLP analysis suggest that wild-type current in north Paraná are unlike from laboratory CDV strains, and this different RFLP pattern may be characterize molecular distinction