Proteção induzida pela fração de alta massa molecular de Paracoccidioides brasiliensis em camundongos BALB/c

Paracoccidioidomicose (PCM) é uma doença infecciosa, granulomatosa, causada por um fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis (Pb), que cresce, no hospedeiro ou em cultivo a 37ºC, sob a forma de levedura ou como micélio (filamentoso) a 25ºC. É uma doença restrita à América Latina e com grandes áreas endêmicas no Brasil, Colômbia, Venezuela e Argentina [1]. Propágulos fúngicos aéreos constituídos de hifas iniciam a infecção com focos nos pulmões, seguido de disseminação linfática ou hematogênica para os linfonodos, fígado, baço, pele e mucosa [3-4]. Nos pulmões ou nódulos linfáticos os granulomas podem permanecer dormentes por anos ou progredir para desencadear uma doença, dependendo da resposta imune do hospedeiro. Em virtude do aumento na proporção de doenças fúngicas como a PCM, sobretudo acarretada pela reativação dos focos dormentes, convém à utilização de imunização terapêutica como tentativa para eliminar os organismos dormentes ou propriamente extinguir a infecção [4], especialmente em doenças cujo tratamento é longo, como o caso da PCM, podendo em alguns casos provocar lesões nefrotóxicas e hepatotóxicas. O maior desafio em experimentos com vacinação contra fungos, de todos os tempos, tem sido identificar substâncias ou partículas inertes fúngicas como proteínas ou carboidratos, que possam ser utilizadas como veículo no processo imunoterápico. Uma das metas e também uma das dificuldades para geração de uma vacina, é a identificação de uma partícula que possa promover uma resposta imune adequada e efetiva. Em se tratando da aracoccidioidomicose, também se tem almejado criteriosamente uma proteção, que no decorrer de alguns estudos está correlacionada com a presença de uma exuberante resposta imune mediada por células. Dados preliminares indicam que imunizações estimulando a liberação de INF-? e injeções de gp43 possam reduzir a concentração do P. brasiliensis nos pulmões de camundongos inoculados intratraquealmente e diminuir a gravidade da inflamação nos pulmões [3] Embora diversos estudos tenham sido feito na intenção de obter uma substância que possa ativar principalmente a resposta imune celular protetora, pouco avanços tem sido observados. No presente trabalho foi introduzido uma nova fração de P. brasiliensis de Alta Massa Molecular (high Mass Molecular)-hMM, com os seguintes objetivos específicos: a) Determinar nível sérico de gp43 solúvel no decorrer da infecção experimental em camundongos imunizados e não imunizados com a fração de hMM. b) Quantificar a presença de células de P. brasiliensis em tecido de camundongos, imunizados e não imunizados com a fração de hMM, utilizando a técnica de CFU-Unidades Formadoras de Colônias. c) Analisar a Reação de Hipersensibilidade Tardia.-DTH, usando como estímulo a fração de hMM. d) Analisar as características histopatológicas dos tecidos (Pulmão, Fígado) com relação às lesões granulomatosas no decurso da infecção experimental em camundongos BALB/c, previamente imunizados ou não com a fração de hMM. e) Determinar os níveis séricos de IgG anti- hMM, IgG anti-gp43 e de IgG anti-ExoAg, no processo de imunização com a fração de hMM, em camundongos BALB/c. Foi utilizado P. brasiliensis (Pb 18) na fase leveduriforme e o Ag CFA obtido de acordo com Camargo [2], modificado pela adição de inibidores de proteases (PMSF). Esta amostra foi fracionada em coluna de Sephadex G200, obtendo-se a fração de hMM, de acordo com (Dissertação de Mestrado-Marquez et al, 2003). Foram utilizados camundongos fêmeas BALB/c divididos em 4 grupos: a) Controle, b)Infectado, c) Imunizado com 50µg da fração de hMM (F-50) e infectados, d) Imunizados com 100µg da fração de hMMc (F-100) e infectados. A análise dos níveis séricos de gp43 solúvel, de IgG anti-hMMc, IgG anti-gp43, IgG anti-ExoAg foi realizada por ELISA, Contagem de Unidades Formadoras de Colônias-CFU, com amostras de pulmão e fígado, Reação de Hipersensibilidade Tardia-DTH com a fração de hMM e Análise Histopatológica, foram realizadas após 28 e 56 dias da infecção. Os resultados demonstraram níveis de antígenos solúveis menores (p<0,001) no período de 28 dias, em relação ao grupo infectado, já para o período de 56 dias, somente os animais imunizados com F-100 da fração de hMM, é que apresentam diferenças significativas (p<0,001). Quanto aos níveis de anticorpos IgG anti-ExoAg e anti-gp43, podemos observar que ambos os grupos F-50 e F-100 apresentaram níveis elevados de anticorpos (p<0,001), em relação aos demais, isto para 28 dias, e 56 dias (p<0,001, p<0,01), respectivamente. Contudo os níveis de IgG anti-hMMc, divergiram entre os grupos F-50 e F-100, visto que em 28 dias somente o grupo F-50, apresentou níveis significativos (p<0,001) se comparado ao grupo infectado. Já no período de 56 dias, somente o grupo F-100, mostrou valores significantes (p<0,05). Para ambos os órgãos analisados pelo CFU (pulmão e fígado), ambos os grupos F-50 e F-100 da fração hMM, apresentaram valores estatisticamente significantes (P<0,001) (pulmão-28 dias) e p<0,05 (pulmão-56 dias), sendo que para fígado o grupo F-50 apresentou (p<0,05) e F-100 (p<0,01), 28 e 56 dias, respectivamente. A reposta imune celular específica mensurada in vivo pelo DTH, foi desenvolvida eficientemente pelos animais que foram previamente imunizados, em ambos os períodos de 28 e 56 dias e grupos F-50 e F-100. A análise das lesões granulomatosas evidenciou, em animais imunizados, um grau de compactação e organização maior, sem a disseminação do fungo para outros órgãos, quando comparado aos animais não imunizados.Paracoccidioidomycosis (PCM) is an infectious, granulomatosa disease, caused for a thermally dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis (Pb), that grows in the host or culture 37ºC, under the form of leavedurifoms or mycelium (filamentous) 25ºC. It is a restricted disease to Latin America and with great endemic areas in Brazil, Colombia, Venezuela and Argentina. Parts fungicus aerial constituted of hifas initiates the infection with focus in the lungs, followed of lymphatic or hematogenics dissemination for the lymph nods, liver, spleens, skin and mucosa. In the lungs or nodules granulomatosis can remain quiescent per years or to progress to unchain a disease, depending on the immune response of the host. In virtue of the increase in the ratio of disease as the PCM, over all caused for the reactivation of the quiescent focus, they use of therapeutically immunization as attempt to eliminate the quiescent organisms or properly to extinguish the infection, especially in disease whose treatment is long, as the case of the PCM, being able in some cases to provoke kidneys and liver lesions. The major challenge in experiments with vaccination against fungus, of all the times, has been to identify to substances or fungus?s inert particles as proteins or carboidrats, which can be used as vehicle in the immunotherapy process. One goals and also one of difficulties for generation of a vaccine, is the identification of a particle that can promote adequate a immune response and accomplishes. In treating to paracoccidioidomycosis, also a protection has been longed for criteriously that during some studies are correlated with the presence of exuberant immune response mediated by cells. Preliminary data indicate that immunizations stimulating the release INF-a and injections of gp43 can reduce the concentration of the P. brasiliensis in the lungs of inoculated mice and to diminish the gravity of the inflammation in the lungs [3]. An even so diverse study has been made in the intention to get a substance that can activate the immune response mainly cellular protector, few advances have been observed. In the present work high Mass Molecular-hMM was introduced a new fraction of P. brasiliensis with the following specific objectives: a) to determine soluble level of gp43 in serum of mice experimental infected and immunized or not immunized with the fraction of hMM. b) Quantified the presence of P. brasiliensis cells in organs of mice immunized and not immunized with the fraction of hMM, using the technique of CFU, c) To analyses the reaction of hypersensitivity-DTH, using as stimulation the fraction of hMM. d) To analyze the histopathology?s characteristics of organs (Lung and Liver) with relation to the granulomatous injuries in the continuation of the experimental infection in BALB/c mice, previously immunized or not with the fraction of hMM, e) to determine in serum the levels of IgG anti-hMM, IgG anti-gp43 and of IgG anti-ExoAg, in the process of immunization with the fraction of hMM, in BALB/c mice. P. brasiliensis (Pb 18) the leveduriforme phase and gotten CFA in accordance with Camargo [2] was used modified for the inhibitor addition of proteases (PMSF). This sample was fractioned in column of Sephadex G200, having gotten itself it fraction of hMM, in accordance with (Marquez et al, 2003). Female mice BALB/c in 4 groups had been used divided: A) Control, b)Infected, c) Immunized with 50µg of the fraction of hMM (F-50) and infected, d) Immunized with 100µg of the fraction of hMMc (F-100) and infected. The analysis of the levels of gp43 soluble, of IgG anti-hMMc, IgG anti-gp43, IgG anti-ExoAg was carried through by ELISA, Counting of Units formatting of Colonies-CFU, with samples of lung and liver, reaction of hypersensitivity-DTH with the fraction of hMM and Histopathology Analysis had been carried after through 28 and 56 days of the infection. The results had demonstrated lesser soluble antigen levels (p<0,001) in the period of 28 days, in relation to the infected group, already for the period of 56 days, the animals immunized with F-100 of the fraction of hMM, only are that they present significant differences (p<0,001). How much to the levels of IgG antibodies anti-ExoAg and anti-gp43, we can observe that both the groups F-50 and F-100 had presented high levels of antibodies (p<0,001) in relation to excessively, this for 28 days, and 56 days (p<0,001, p<0,01), respectively. In longer period of 56 days, only the F-100 group, showed significant values (p<0,05). For both (lung and liver) the organs analyzed for the CFU, both the groups F-50 and F-100 of the fraction hMM, had presented significant P values (p<0,001) (in lung 28 days) and p<0,05 (lung-56 days), being that for liver the F-50 group presented (p<0,05) and F-100 (p