Detecção simultânea de Salmonella spp. e Salmonella enteritidis em carcaças de frango por reação em cadeia da polimerase

Um aumento de salmonelose humana causada pelo sorovar Enteritidis relacionado com o consumo de carne de aves, ovos e derivados foi observado em todo o mundo nos últimos anos. A implantação do Sistema de Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle (APPCC), embora tenha diminuído o número de aves contaminadas, não foi capaz de eliminar o problema. A salmonelose é a doença alimentar de origem bacteriana mais prevalente no Paraná e o sorovar Enteritidis foi responsável por aproximadamente 80% dos surtos ocorridos nesse Estado, entre 1999 e 2006. Como S. Enteritidis não provoca sintomas clínicos graves nas aves, o monitoramento da sua presença em alimentos é muito importante para o controle da doença humana. Os métodos convencionais de isolamento de Salmonella em alimentos, água ou amostras ambientais são muito demorados. Devido à rapidez, especificidade e sensibilidade, métodos moleculares, como a reação em cadeia da polimerase (PCR), têm sido padronizados para detecção e identificação de Salmonella em alimentos. O objetivo deste trabalho foi padronizar um ensaio PCR multiplex para a detecção de Salmonella spp. e identificação simultânea de Salmonella Enteritidis em carcaças de frango. A PCR foi padronizada utilizando-se os pares de iniciadores INV A, específico para Salmonella spp. e IE1, específico para o sorovar Enteritidis, resultando em fragmentos amplificados de DNA alvo específicos de 796 e 316 pares de base, respectivamente. A especificidade do ensaio PCR padronizado, testada com culturas puras de diferentes sorovares de Salmonella e outras espécies bacterianas, foi de 100%. Após 24 h de enriquecimento não seletivo foi possível detectar aproximadamente 1 unidade formadora de colônia (UFC) de Salmonella por 10 g de pele de frango artificialmente contaminada. Das 66 amostras de carcaça de frango analisadas, adquiridas no comércio de Londrina, nove (13,0%) estavam contaminadas com Salmonella spp. A presença dessa bactéria foi confirmada pelo método tradicional de cultura e identificados os sorovares Schwarzengrund e Montevideo, respectivamente, em seis e em três amostras. Através da PCR foram detectados fragmentos de DNA específicos que confirmaram a presença do gênero Salmonella, porém não do sorovar Enteritidis. A PCR multiplex padronizada apresentou sensibilidade e especificidade para detectar o gênero Salmonella e, simultanemante identificar o sorovar Enteritidis, em carne de frango, após 24 horas de análise.An increase in human salmonellosis caused by serovar Enteritidis related to consumption of poultry products was observed worldwide in the last years. Safety measures have been adopted to control this serovar. The implementation of Hazard Analysis and Critical Control Points (HACCP) System was not able to eliminate the problem although it has considerably reduced the number of infected chickens. Salmonellosis is the most frequent bacterial foodborne disease in Parana State, Brazil and serovar Enteritidis caused approximately 80% of outbreaks occurred between 1999 and 2006. S. Enteritidis causes subclinical infection in chickens. Thus, the constant checking of Salmonella contamination in the food chain is essential to control human disease. Salmonella detection in food, water or environmental samples by traditional methods is labor-intensive and time-consuming. Molecular methods, such as polymerase chain reaction (PCR), are rapid, specific and sensitive and several methods have been developed to detect and identify Salmonella in foods. The objective of this study was to develop a multiplex PCR for detection of Salmonella spp. and Salmonella Enteritidis in chicken carcasses. A PCR was developed using Salmonella genus-specific primers INVA and serovar Enteritidis-specific primers IE1, which produce specific DNA fragments of 796 and 316 base-pairs, respectively. The standardized PCR was tested with different isolates of Salmonella and other bacterial species and the specificity was 100%. Salmonella was detected from chicken skin artificially contaminated with approximately 1 colonyforming unit (CFU) of Salmonella per 10 g, after 24 h of non-selective enrichment. Salmonella spp. was detected in nine (13%) of 66 analyzed chicken carcasses purchased from local retail market. The presence of Salmonella was confirmed by traditional culture method and serovars Schwarzengrund and Montevideo were identified in six and three carcass samples, respectively. Specific DNA fragments of the PCR confirmed the presence of genus Salmonella, but not serovar Enteritidis. The standardized multiplex PCR was found to be sensitive and specific on the detection of genus Salmonella and simultaneous identification of serovar Enteritidis in chicken meat after 24 hours of analysis