Caracterização in silico e in vivo de genes das vias de biossíntese de isoprenóides em coffea spp

Os diterpenos cafestol e caveol, presentes na fração lipídica em grãos de café, originam-se da via de síntese de isoprenóides. Em vegetais superiores, duas vias localizadas em compartimentos intracelulares separados estão envolvidas na biossíntese de isopentenil difosfato (IPP) e do isômero dimetilalil difosfato (DMAPP). No citosol IPP é derivado da via do ácido mevalônico (MVA), e no plastídeo é formado pela via do metileritritol fosfato (MEP). Visando estudar os genes envolvidos na biossíntese dos isoprenóides, foram realizadas buscas por palavras-chave no banco de dados do Projeto Genoma Café e analisadas as seqüências dos genes 3-hidroxi-3metilglutaril-CoA redutase (HMGR) e mevalonato difosfato decarboxilase (MPDC) para a via MVA e 1-deoxi-D-xilulose 5-fosfato reductoisomerase (DXR) e isopentenil difosfato sintase (IDS) para a via MEP. O número de isoformas dos genes analisados, DXR, IDS e HMGR de Coffea são os mesmos relatados para Arabidopsis thaliana, com exceção de MPDC. A seqüência completa de MPDC só foi possível após clusterização das sequências de MPDC do banco do Projeto Genoma Café com as seqüências do banco HarvEST. As análises de expressão por Northern blot em diferentes fases de desenvolvimento do fruto, folha jovem e expandida exposta à luz, botão floral jovem e maduro, ramo e raiz de C. arabica detectaram principalmente transcritos de DXR no início do desenvolvimento de perisperma, em botão floral e folhas expostas à luz. Transcritos da isoforma CaHMGR1 foram observados em polpa e na fase inicial de desenvolvimento de perisperma e endosperma, assim como em botão floral e folhas expostas à luz. Para CaHMGR2 foram observados transcritos em todos os tecidos analisados e em todas as fases de desenvolvimento do fruto. Os resultados sugerem expressão constitutiva da isoforma CaHMGR2, enquanto a isoforma CaHMGR1 teria indução específica. O gene DXR apresentou maior transcrição que HMGR tanto através das análises obtidas in silico com in vivo. A análise in silico permitiu uma adequada predição do número de isoformas e da atividade dos genes estudados, no entanto é necessário a confirmação desses resultados in vivo, como demonstrado para os genes de HMGR.The diterpenes khaweol and cafestol, which are present in the coffee lipid fraction, are originated from the isoprenoid pathway. In higher plants, there are two independent pathways located in the cytosol (mevalonic acid or MVA pathway) and in the plastids (methylerythritol phosphate – MEP pathway). Throughout the data mining of the Brazilian Coffee Genome Project we studied the genes that code for the enzymes 3-hydroxy-3-methyglutaryl-CoA reductase (HMGR) and mevalonate diphosphate decarboxylase (MPDC) for the MVA pathway and 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase (DXR) and isopentenyl diphosphate/dimethylallyl diphosphate synthase (IDS) for the MEP pathway. The number of isoforms of the genes datamined was the same reported for Arabidopsis thaliana, with the exception for the MPDC that has two isoforms in A. thaliana. Northern blots analysis in different tissues of coffee fruits during maturation, as well as in buds, roots, shoots and leaves detected transcripts of DXR in the initial development of perisperm, flower buds and leaf. Analysis of two HMGR isoforms showed transcription of CaHMRG2 in all tissues and fruit development stages analysed. Meanwhile, CaHMRG1 was observed in pulp, at the initial stages of perisperm and endosperm, and similar do DXR, in flower buds and leaf. Those results suggest a constitutive expression of isoform CaHMGR2, while the isoform CaHMGR1 would have specific induction. The in silico analysis was able to predict most of the number of isoforms and gene activity, but in vivo experiments to confirm the in silico data are necessary