Detection and Molecular Characterization of Cryptosporidium spp. and Giardia spp. in Raw and Treated Water in A Public Water-Treatment System

A água é um dos principais veículos de patógenos que causam doenças na população. Em muitos países em desenvolvimento a infraestrutura para fornecimento de água potável é incompleto ou ausente e existem elevados níveis endêmicos de doenças transmitidas pela água. Os protozoários zoonóticos Cryptosporidium spp. e Giardia spp. possuem uma grande capacidade de impactos negativos na população humana e animal. Ambas as espécies resistem ao tratamento convencional da água. O risco representado pela presença de Cryptosporidium e Giardia tornou-se uma grande preocupação para as autoridades sanitárias e empresas responsáveis pelo fornecimento de água potável para consumo humano e animal. A Portaria 2914/11 do Ministério da Saúde exige um padrão de ausência desses dois protozoários em águas destinadas ao consumo humano. O objetivo desse estudo foi detectar Cryptosporidium spp. e Giardia spp. em água bruta e tratada em um sistema público de tratamento de água, situado no município de Londrina, Paraná, Brasil. Entre setembro de 2012 e setembro de 2013, foram coletadas amostras de água bruta (30L) e água tratada (100L), quinzenalmente, em um total de 48 amostras. As amostras foram examinadas por meio da Técnica da Membrana Filtrante, utilizando-se membranas com 47mm de diâmetro e 1,2?m de porosidade e um kit portátil de filtração à vácuo ajustado para 4L/min. O material retido na membrana foi mecanicamente extraído pela raspagem da sua superfície, eluído em solução de Tween 80 a 1%, centrifugado duas vezes e o sedimento resultante utilizado para as analises. A partir das amostras foi realizada a imunofluorescência direta para oocistos de Cryptosporidium spp. e cistos de Giardia spp., utilizando-se o kit comercial Merifluor® (Meridian Bioscience). Realizou-se a extração de DNA com o kit comercial NucleoSpin Tissue® (Macherey-Nagel) e a reação de nested-PCR (n-PCR) para a detecção dos protozoários e eletroforese em gel de agarose. Os genes alvos foram o 18S rRNA para Cryptosporidium (produto final de 819-825 pares de bases) e 16S rRNA para Giardia (produto final de 292-297 pares de bases). Na imunofluorescência as amostras de água bruta foram positivas, sendo detectada Giardia spp. em 2/24 (8.33%) amostras analisadas. Na n-PCR, 6/24 (25%) das amostras de água bruta foram positivas para Giardia spp. e 2/24 (8.33%) para Cryptosporidium spp. Das amostras de água tratada, na n-PCR, 1/24 (4.16%) foi positiva para Giardia spp. e todas foram negativas para Cryptosporidium spp. O sequenciamento demonstrou C. parvum em ambas as amostras de água bruta. Após o sequenciamento foi identificada DNA de Giardia duodenalis em duas amostras de água bruta. Nas três amostras de água bruta e na amostra de água tratada inicialmente positivas à n-PCR, após o sequenciamento, demonstrou-se que o DNA pertencia à bactéria ambiental Nakamurella multipartita. Houve correlação moderada entre turbidez (r = 0.5422; p = 0.0061) e cor (r = 0.4491; p = 0.0277) e a presença de Cryptosporidium spp. na água bruta, e entre turbidez (r = 0.5809; p = 0.0029) e a presença de Giardia spp. em água bruta. A presença desses protozoários em águas de manancial de abastecimento aponta a real necessidade de monitoramento e especial atenção das companhias de tratamento de água da região, considerando a Portaria 2914/11 do Ministério da Saúde.Water is one of the main sources of pathogens that cause diseases in the population. In many developing countries the infrastructure for providing safe drinking water is fragmentary or absent and there are high endemic levels of waterborne disease. The zoonotic protozoan Cryptosporidium spp. and Giardia spp. have a great infective capacity of causing a negative impact on human and animal health. Both parasites are resistant to conventional water treatment. The risk posed by the presence of Cryptosporidium and Giardia has become a major concern for the sanitary authorities and companies responsible for providing safe drinking water supplies for human and animal consumption. The Brazilian law n.2914/11 from Ministry Health requires a standard of absence of these two protozoans in water for human consumption. The aim of this study was to detect the occurrence of Cryptosporidium spp. and Giardia spp. in raw and treated water in a public water treatment system, located in Londrina city, Parana State, Brazil. From September 2012 to September 2013, samples of raw (30L) and treated water (100L) were collected every two weeks, in a total of 48 samples. The samples were examined by Membrane Filtration Technique, using membranes with 47mm in diameter and 1.2?m porosity with a filtration kit and a portable vacuum pump, adjusted to 4L/min. The material retained on the membrane was mechanically extracted by scraping its surface with a solution of 1% Tween 80 for elution. The material was centrifuged twice and the sediment resulting was analyzed. Was performed direct immunofluorescence for Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts, using the commercial kit Merifluor® (Meridian Bioscience) Also performed DNA extraction using a commercial kit NucleoSpin Tissue® (Macherey-Nagel). The DNA extracted was submitted to nested-PCR reaction (n-PCR) for the detection of protozoans and electrophoresis in agarose gel. The target genes were 18S rRNA for Cryptosporidium (final product 819-825 base pairs) and 16S rRNA for Giardia (final product 292-297 base pairs). In the immunoflurescence, samples of raw water were positive to Giardia spp. in 2/24 (8.33%) from the analyzed samples. In n- PCR, raw water samples were positive in 6/24 (25%) for Giardia spp. and in 2/24 (8.33%) for Cryptosporidium spp. In treated water 1/24 (4.16%) of the samples was positive to Giardia spp. and all samples were negative for Cryptosporidium spp. The sequencing showed C. parvum DNA in both samples of raw water. After the sequencing was identified G. duodenalis DNA in two samples of raw water. Three positive samples of raw water and the positive sample of treated water to Giardia spp. in n-PCR, after sequencing, showed DNA concerning to the environmental bacteria Nakamurella multipartita. There was moderate correlation between turbidity (r = 0.5422; p = 0.0061) and colour (r = 0.4491; p = 0.0277) and presence of Cryptosporidium spp. in raw water and between turbidity (r = 0.5809; p = 0.0029) and presence of Giardia spp in raw water. The n-PCR proved to be a highly sensitive technique for the diagnosis of Cryptosporidium spp. and Giardia spp. The presence of these protozoans in the water supply indicates the need of monitoring and special attention considering the law n.2914/11 by water treatment companies of region