Avaliação da imunidade protetora em frangos de corte vacinados com proteína recombinante rHsp70 de Eimeria tenella

A epidemiologia da coccidiose aviária caracteriza-se por uma grande disseminação de oocistos no meio ambiente, podendo ocorrer significantes prejuízos em granjas com aves infectadas, fazendo-se necessárias, portanto, medidas profiláticas para o seu controle. Estas medidas são realizadas principalmente com o uso de anticoccídicos adicionados à ração. No entanto, o manejo incorreto e a falta de critérios definidos para o uso dessas drogas têm gerado sérios problemas de resistência. Somando-se a esse quadro, existe a pressão do mercado consumidor para banir drogas da alimentação animal. Pesquisas que visam à obtenção de vacinas para o controle da coccidiose são realizadas com a finalidade de buscar alternativas frente à quimioterapia usual. O objetivo do presente estudo foi clonar e expressar o gene HSP70 de E. tenella em Escherichia coli, bem como, imunizar frangos de corte e avaliar a imunidade protetora. Para isso 80 aves da linhagem Cobb, machos e fêmeas, com um dia de idade, foram alojadas em baterias metálicas com fornecimento de ração e água ad libitum, as quais foram distribuídas em quatro grupos (G1, G2, G3, e G4) com 20 aves cada. No sétimo dia do experimento os animais foram separados e os tratamentos realizados como segue: G1 – aves vacinadas com a proteína rHSP70 associada ao adjuvante (Quil-A, 50g), G2 – aves não imunizadas e não desafiadas, G3 – aves não imunizadas e desafiadas e G4 – aves inoculadas com adjuvante Quil A (50g). Foram realizadas duas doses da vacina via sub-cutânea, com 15 e 50g nos dias 7 e 14, respectivamente. O mesmo foi realizado no G1 e G4 com PBS. No dia 24 foi feito o desafio com 5,0x104 oocistos de Eimeria tenella em todos os grupos, exceto o G2. Para a clonagem foi realizada a extração do RNA total dos esporozoítos pelo reagente TRIzol® de acordo com as instruções do fabricante. O cDNA foi obtido a partir do de 1 μg de RNA total através do kit de Protoscript® M-MuLV. Os oligonucleotídeos iniciadores específicos para o gene HSP70 foram confeccionados a partir da sequência Z46965 depositada no Genbank. Em seguida, os fragmentos de DNA necessários para a clonagem foram obtidos pela técnica de reação em cadeia pela polimerase (PCR), utilizando os oligonucleotídeos acima citados. A clonagem dos genes foi realizada no vetor pTrcHis2 TOPO® (Invitrogen, USA). Após a clonagem em bactérias E. coli, a proteína foi expressada e apresentou um tamanho de 23kDa, com rendimento de 5mg/L. Quando avaliado a imunidade protetora, a eliminação de oocistos apresentou diferença significativa entre os tratamentos, sendo que a taxa de aumento da fecundidade dos oocistos do grupo vacinado com rHSP70 foi 66% maior em relação aos grupos controles desafiados. Não houve diferença entre os tratamentos para o ganho de peso e escore de lesão. O título de anticorpos dos dias 24 e 31 do grupo vacinado com rHSP70 apresentou uma densidade óptica pelo menos duas vezes maior em relação aos grupos controles desafiados. A concentração de luteína plasmática do grupo vacinado não diferiu do grupo controle não desafiado. Com base nos resultados obtidos, conclui-se que a proteína rHSP70 promoveu um aumento da fecundidade dos oocistos e a concentração de luteína plasmáticas manteve-se nos mesmos níveis das aves não desafiadas, indicando uma proteção parcial contra o desafio realizado.The epidemiology of avian coccidiosis is characterized by a wide spread of oocysts in the environment, significant damage may occur on farms with infected birds, making it necessary, therefore, preventive measures for their control. These steps are mainly carried out with the use of anticoccídicos added to the feed. However, mismanagement and lack of criteria for the use of these drugs have generated serious resistance problems. Adding to this picture, there is the pressure of the consumer market for drugs ban animal feed. Research projects aimed at obtaining vaccines for the control of coccidiosis are performed in order to find alternatives to chemotherapy usual front. The aim of this study was to clone and express the gene HSP70 E. tenella in Escherichia coli, as well as immunize broiler chicks and assess protective immunity. For this 80 Cobb broilers, male and female, with a day old, were housed in battery cages to provide food and water ad libitum, which were divided into four groups (G1, G2, G3, and G4) with 20 chicks each. On the seventh day, the animals were separated and the treatments performed as follows: G1 - birds vaccinated with the protein rHSP70 associated with adjuvant (Quil-A, 50g), G2 - birds unimmunized and unchallenged, G3 - birds do not immunized and challenged and G4 - birds inoculated with adjuvant Quil A (50 g). There were two doses of the vaccine subcutaneously with 15 and 50g on days 7 and 14, respectively. The same was done in G1 and G4 with PBS. On day 24 the challenge was made with 5.0 x104 oocysts of Eimeria tenella in all groups except the G2. For cloning was performed from total RNA extracted from sporozoites by TRIzol ® reagent according to the manufacturer's instructions. The cDNA was obtained from 1g of total RNA using the kit Protoscript ® M-MuLV. Primers specific for the HSP70 gene were constructed from the sequence deposited in Genbank Z46965. Then, the DNA fragments required for cloning were obtained by the technique of polymerase chain reaction (PCR) using the primers described above. The cloning of the genes was performed at pTrcHis2 TOPO ® vector (Invitrogen, USA). After cloning in bacteria E. coli, protein was expressed and presented a size of 23kDa, yield 5 mg /L. When evaluated protective immunity, oocysts shedding significant difference between treatments, and the rate of increase in fecundity of oocysts rHSP70 vaccinated group was 66% higher compared to control groups challenged. There was no difference between treatments for weight gain and lesion score. The antibody titer on days 24 and 31 of the vaccinated group rHSP70 presented an optical density at least two fold higher compared to control groups challenged. The plasma concentration of lutein in the vaccinated group did not differ from the control group was not challenged. Based on these results, it is concluded that the protein rHSP70 promoted an increase in fertility of oocysts and plasma lutein concentration remained at the same levels of unchallenged birds, indicating partial protection against challenge done