Atividade antiviral de polissacarídeos isolados de Azadirachta indica na infecção por poliovírus e herpesvírus, in vitro

O poliovírus (PV), agente etiológico da poliomielite, é um vírus não envelopado com genoma de RNA fita-simples, positiva. Atualmente, a doença está controlada na maior parte dos países, mas, ainda é endêmica na África e Ásia. Os herpesvírus são vírus envelopados, com DNA de fita-dupla e possuem uma ampla gama de hospedeiros, além de causarem infecções persistentes com possíveis reativações. O herpesvírus bovino-1 (BoHV-1) produz diversas infecções, como, rinotraqueíte, vulvovaginite, balanopostite e infecções sistêmicas fatais. O vírus herpes simplex-1 (HSV-1) ocasiona infecções em humanos, normalmente, benignas, porém, em indivíduos imunocomprometidos pode levar a infecção generalizada, encefalite e ceratoconjuntivite. Além da importância médica e animal, esses agentes são modelos de vírus de RNA e DNA, para diversos estudos in vitro. A Azadirachta indica (nim) tem sido amplamente utilizada etnofarmacologicamente para o tratamento de diversas doenças, entre elas as infecções virais, sendo algumas com base científica. Neste trabalho avaliamos a atividade antiviral dos polissacarídeos (P1 e P2) e seus derivados químicos sulfatados (P1S e P2S), obtidos de A. indica, na infecção por PV, BoHV-1 e HSV-1, em células HEp-2. A citotoxicidade foi avaliada pelo MTT, a atividade antiviral pelo ensaio de redução de plaques (PRA) e a inibição da síntese proteica viral pela reação de imunofluorescência (IF). A reação em cadeia de polimerase (PCR) foi aplicada para estudar a inibição da síntese do DNA na replicação do HSV-1. Demonstramos que P1 e P1S inibiram a replicação do BoHV-1, com concentração inibitória 50% (CI50)/índice de seletividade (IS) de 105,2µg/ml/3,6 e 32,1µg/ml/>51,4, respectivamente, sendo P1S mais efetivo que P1. P1 e P1S demonstraram inibição dose-dependente na síntese proteica. A maior inibição foi encontrada quando os compostos foram adicionados simultaneamente a infecção (tempo 0h). Os compostos testados exibiram efeito antiviral contra o PV, com CI50 de 80µg/ml (P1), 37,5µg/ml (P1S), 77,5µg/ml (P2) e 12,1µg/ml (P2S) e IS variando de 18-131,9, demonstrando também, melhor efeito inibitório no tempo 0h. Quando testados contra HSV-1, P1S e P2S também exibiram melhor atividade antiviral no tempo 0h, com CI50/IS de 31,1µg/ml/> 51,4 e 80,5µg/ml/>19,8, respectivamente. Os compostos apresentaram pequeno efeito profilático, cerca de 20%. O P1S demonstrou melhor efeito inibitório de 91,8% em comparação com P1 (50%), P2 (71,1%) e P2S (70%) em 200µg/ml. A inibição da síntese proteica foi dose-dependente, em concordância com os resultados de PRA. Os polissacarídeos inibiram a síntese de DNA do HSV-1 em todas as concentrações testadas no PRA, para P1 e P1S, e até 50µg/ml, para P2 e P2S. Neste caso, os grupos sulfatos de P1S e P2S não alteraram o efeito inibitório dos polissacarídeos originais. Portanto, os nossos resultados demonstraram a atividade antiviral dos polissacarídeos de A. indica contra PV, BoHV-1 e HSV-1 com ação nas fases iniciais da replicação, além da inibição da síntese proteica viral e ação virucida. A inibição em etapas diferentes da infecção viral representa uma vantagem em relação aos antivirais convencionais que, normalmente, atuam em uma única etapa, com menor probabilidade de selecionar mutantes resistentes, além da inocuidade e de outros benefícios relatados.Poliovirus (PV), etiological agent of poliomyelitis, is a non-enveloped and positive single-stranded RNA virus. The disease is under control in most part of the world, but, remains endemic in some countries in Africa and Asia. The herpesvirus is an enveloped and double-stranded DNA virus, and has a broad host range and establishes persistent infections in neurons ganglia. Bovine herpesvirus-1 (BoHV-1) is the causal agent of various infections, such as, rhinotracheitis, vulvovaginitis, balanoposthitis, and fatal systemic infections. The herpes simplex virus (HSV) usually causes benign infections in humans, but, can be serious in immunocompromised leading to generalized infections, encephalitis and keroconjunctivitis. Besides the animal and medical importance, these agents are used as models of RNA and DNA virus for many in vitro studies. The Azadirachta indica (nim) has been widely used in Indian ayurvedic and homeopathic medicine for treatment of several diseases, including viral infections. We evaluated the antiviral activity of A. indica polysaccharides (P1 and P2) and their chemical sulfated derivatives (P1S and P2S), in PV, BoHV-1 and HSV-1 infection, in HEp-2 cells. The cytotoxicity of the compounds was evaluated by MTT and the antiviral activity was determined by the plaques reduction assay (PRA). The inhibition of viral protein synthesis was conducted by immunofluorescence (IF). The polymerase chain reaction (PCR) used to evaluate the inhibition of DNA synthesis in HSV-1 replication. P1 and P1S inhibited the replication of BoHV-1, with following inhibitory concentration 50% (IC50)/selectivity index (SI), 105.2 μgml-1/3.6 and 32.1μgml-1/>51.4, respectively, and P1S was more effective than P1. P1 and P1S presented a dose-dependent inhibition in protein synthesis. The greatest inhibition was found when the compounds were added simultaneously with infection (time 0h). The compounds also exhibited effect against PV, with IC50 of 80μg/ml (P1), 37.5μg/ml (P1S), 77.5μg/ml (P2) and 12.1μg/ml (P2S) and SI ranged of 18 to 131.9, showing also better inhibitory effect at the time 0h. For HSV-1, P1S and P2S showed effect, with better results also at the time 0h and IC50/SI of 31.1μgml-1/>51.4 and 80.5μgml-1/>19.8, respectively. The compounds demonstrated low prophylactic effect, about 20%. P1S presented better inhibitory effect, 91.8% compared to P1 (50%), P2 (71.1%) and P2S (70%), at 200μg/ml. Inhibition of protein synthesis was dose-dependent, corroborating with the results of PRA. The polysaccharides inhibited the HSV-1 DNA synthesis at all tested concentrations in PRA, for P1 and P1S, and up to 50μg/ml for P2 and P2S. In this case, sulfated derivatives (P1S and P2S) did not differ their inhibitory effect in comparison to original polysaccharides. Therefore, our results demonstrated A. indica polysaccharides were active for PV, BoHV-1 and HSV-1 replication, suggesting effect at early stages of replication, however, virucidal effect and inhibition of viral protein were also shown. The action at several stages of viral infection represents an advantage over the one-step effect of conventional drugs by the less possibility to select resistant mutants. Moreover, the use of natural products can represent lower toxicity, beyond other benefic features