Produção de beta-(1-3)-glucanase e beta-glicosidase pelo isolado de levedura 1WA1 utilizando-se biomassa micelial de Botryosphaeria rhodina MAMB-05

Enzimas microbianas têm sido aplicadas em várias indústrias para diferentes processos. Beta-(1→3)-glucanases são hidrolases que degradam ligações glicosídicas beta-1,3 e têm sido descritas como sendo do tipo exo-(EC 3.2.1.58) e endo-(EC 3.2.1.39). As beta-glucosidases (EC 3.2.1.21) também pertencem ao complexo enzimático glucanolítico e hidrolisam ligações glicosídicas de dissacarídeos, oligossacarídeos, e ligações entre glucose e grupos agliconas que ocorrem em muitos compostos fenólicos e aromáticos voláteis presentes em frutas. Estas enzimas hidrolíticas são produzidas por fungos filamentosos e leveduras e podem ser úteis em vários processos biotecnológicos, incluindo-se a produção de bebidas como vinhos e sucos de frutas, para melhorar as suas características organolépticas. Neste trabalho, 108 micro-organismos foram isolados da filosfera de uvas produzidas no norte do Estado do Paraná e do Rio Grande do Sul. Os isolados foram selecionados quanto à produção de beta-(1→3)-glucanase e beta-glicosidase utilizando-se o exopolissacarídeo (EPS) botriosferana, uma beta-(1→3; 1→6)-D-glucana produzida pelo fungo ascomiceto Botryosphaeria rhodina MAMB-05. O melhor micro-organismo produtor dos maiores títulos de enzima foi uma levedura, 1WA1, isolada de uva Moscato Bailey na região de Londrina. Pó de Micélio (1g % m/v) de B. rhodina MAMB-05 crescido nas condições ótimas para a produção de botriosferana, foi o melhor substrato para a produção de beta-(1→3)-glucanase pelo isolado 1WA1, em 96 h a 28 °C (180 rpm). A atividade da beta-(1→3)-glucanase foi otimizada e os ensaios foram desenvolvidos incubando-se a enzima em tampão citrato fosfato pH 4,5 com laminarina 0,4 % (m/v) como substrato, por 20 minutos a 60°C. A atividade foi determinada pela quantificação dos açúcares redutores liberados. Para o ensaio da atividade da beta-glicosidase, a enzima foi incubada em tampão acetato de sódio (pH 4,0) a 75°C por 20 min, utilizando-se p-NPG (p-nitrofenil beta-D-glicopiranosídeo) como substrato, e quantificando-se o p-nitrofenol liberado. Os valores de KM aparente da beta-(1→3)-glucanase e da beta-glicosidase foram 0,09 mg laminarina /mL e 0,04 mg p-NPG /mL, respectivamente, e os respectivos Vmáx foram 1,07 e 0,011 µmol/min. A beta-(1→3)-glucanase da levedura foi inibida fortemente por Mn++ e parcialmente por Cu++ e Zn++, enquanto que a beta-glicosidase foi também inibida por Mn++ e Cu++ e parcialmente por Zn++. Um planejamento fatorial 32 completo e análise por metodologia de superfície de resposta foram desenvolvidos para otimizar a produção de beta-(1→3)-glucanase e beta-glicosidase, avaliando-se as variáveis: X1 (concentração de biomassa micelial de B. rhodina) de 0,5 a 1,5 (g % m/v), e X2 (pH inicial do meio de cultivo) de 2,5. a 7,5 . As condições ótimas de cultivo foram: 1,5 g% de biomassa micelial, pH inicial 2,5 durante 96 h a 28 °C e 180 rpm. A atividade específica preditiva da produção de beta-(1→3)-glucanase foi 5,92 U/mg, e o valor experimental obtido foi 5,96 U/mg. Para a beta-glicosidase o valor preditivo foi 1,73 U/mg, enquanto que o experimental foi 1,77 U/mg, nas condições de cultivo descritas para a produção da beta-(1→3)-glucanase. A microscopia eletrônica de varredura mostrou que o isolado de levedura (1WA1) apresentou evidências de degradação na parede celular do micélio do B. rhodina MAMB-05, usado como substrato para produzir ambas as enzimas estudadas neste trabalho.Microbial enzymes find applications in several industries for many different processes. Beta-(1→3)-glucanases are hydrolases that degrade beta-1,3-glucosidic linkages and have been described as exo-(EC 3.2.1.58) and endo- (EC 3.2.1.39) acting type. Beta-glucosidases (EC 3.2.1.21) also belong to the beta-glucanolytic enzymatic complex, and hydrolyse glucosidic linkages of disaccharides, oligosaccharides, and the linkages between glucose and aglycone groups that occur in many volatile phenolic and aromatic compounds present in fruits. These hydrolytic enzymes are produced by filamentous fungi and yeasts, and can be useful in biotechnological process, including the production of wines and fruit beverages to improve their organoleptic characteristics. In this work, 108 microorganisms were isolated from the phyllosphere on grapes collected in the wine growing areas in the north of the state of Paraná, and in Rio Grande do Sul. The isolates were screened for beta-(1→3)-glucanases and beta-glicosidase using the exopolysaccharide (EPS) botryosphaeran (beta-(1→3)(1→6)-D-glucan) from the ascomycete, Botryosphaeria rhodina MAMB-05. The microorganism producing highest enzyme titres was a yeast, isolate 1WA1, isolated from Moscato Bailey grapes taken from the Londrina region. Ground mycelium (1% w/v) from B. rhodina MAMB-05 grown under optimal conditions for botryosphaeran production was found to be the best substrate to produce beta-(1→3)-glucanases by the isolate 1WA1 in 96 h at 28 °C (180 rpm). Beta-(1→3)-glucanase activity was optimized, and assays performed by incubating enzyme in citrate phosphate buffer (pH 4.5) with laminarin 0.4 % (w/v) as the substrate for 20 min at 60°C. Activity was determined by measuring the reducing sugars released. For assay of beta-glucosidase activity, enzyme was incubated in sodium acetate buffer (pH 4.0) at 75 °C for 20 min using p-NPG (p-nitrophenyl-beta-D-glucopyranoside) as substrate, and measuring the amount of p-nitrophenol released. The apparent KM for beta-(1→3)-glucanase and beta-glucosidase was 0.09 mg laminarin /mL and 0.04 mg p-NPG /mL, resp., and the respective Vmáx were 1.07 and 0.011 µmol/min. The yeast beta-(1→3)-glucanase was strongly inhibited by Mn++, and partially by Cu++ and Zn++, while the beta-glucosidase was also inhibited by Mn++ and Cu++, but partially by Zn++. A completed experimental 32 factorial design and analysis by response surface methodology was developed to optimize beta-(1→3)-glucanase and beta-glucosidase production evaluating the variables: X1 (concentration of mycelial biomass of B. rhodina) from 0.5 to 1.5, % w/v), and X2 (nutrient medium initial pH, from 2.5 to 7.5). The optimal culture conditions were: 1.5 % of mycelium biomass, initial pH 2.5 over 96 h cultivation at 28 °C, and 180 rpm. The predicted specific activity of beta-(1→3)-glucanase production was 5.92 U/mg, and the experimental value obtained was 5.96 U/mg. For beta-glucosidase the predicted value was 1.73 U/mg while the experimental value obtained was 1.77 U/mg under the same culture conditions described for beta-(1→3)-glucanase production. Scanning electron microscopy revealed that the yeast isolate (1WA1) showed evidences of cell wall degradation of the mycelium B. rhodina MAMB-05 used as substrate to produce both of the enzymes studied in this work