Phylogenetic identification and technological characterization of the autochthonous lactic acid microbiota of the artisanal Serrano Catarinense cheese and its antagonistic potential to pathogens

Os queijos artesanais vêm sendo produzidos há séculos no Brasil. Cada região do país produz queijos com características sensoriais próprias e distintas entre si. A fabricação informal do queijo artesanal no município de Lages, no estado de Santa Catarina, é uma prática muito antiga e de grande aceitação em diferentes camadas da sociedade. O queijo artesanal serrano, assim como outros queijos artesanais, utiliza leite cru integral como matéria prima. O objetivo deste trabalho foi identificar no queijo artesanal serrano a microbiota patogênica e lática, caracterizar a diversidade genetica dessa microbiota lática, avaliar o seu potencial antagonista frente a patógenos, assim como suas características tecnológicas para integrar um fermento lático. Foram estudadas 20 amostras de queijos adquiridas em diferentes pontos comerciais da cidade de Lages/SC. Em relação à ocorrência de bactérias patogênicas nas amostras de queijo Serrano, Listeria monocytogenes foi identificada em três amostras de queijo, Staphylococcus coagulase positivos em sete amostras e 11 amostras apresentaram-se contagens acima do estabelecido pela legislação para Escherichia coli. Salmonella spp. não foi isolada em nenhuma das amostras analisadas. Foram obtidos 543 cepas de bactérias ácido láticas (BAL) a partir das 20 amostras de queijos artesanais Serrano. As cepas foram agrupadas de acordo com os perfis de polimorfismo de restrição do espaço intergênico 16S-23S (RFLP PCR-ITS). Exemplares destes grupos foram selecionadas para o sequenciamento do gene 16S RNAr, que identificou 268 (49,3%) cepas de Lactobacillus spp., 208 (38,3%) de Lactococcus spp., 34 (6,3%) de Leuconostoc spp. e 33 (6,1%) de Enterococcus spp. Das 543 cepas de BAL analisadas, Lactobacillus spp. mostrou o maior potencial antagonista a Listeria monocytogenes. O Enterococcus spp. apresentou antagonismo principalmente contra Escherichia coli e Salmonella Thyphimurium. O gênero Leuconostoc spp. mostrou maior antagonismo para Staphylococcus aureus. Em relação às características tecnológicas, 74 cepas de BAL foram selecionadas aleatoriamente, mas contemplando os três gêneros com potencial tecnológico, um total de 12 isolados Leuconostoc, 19 Lactococcus e 43 Lactobacillus. As cepas de Lactococcus foram avaliadas para atividade acidificante, proteolítica, autolítica, aminopeptidásica, produção de aminas biogênicas, resistência ao NaCl e a temperatura. As cepas de Leuconostoc foram avaliadas para atividade acidificante, proteolítica, autolítica, aminopeptidásica, lipolítica, produção de aminas biogênicas, produção de dextrano, resistência ao NaCl e acidez. As cepas de Lactobacillus foram avaliadas para atividade acidificante, proteolítica, autolítica, lipolítica, aminopeptidásica, produção de aminas biogênicas. Das 19 cepas de Lactococcus, 4 Lactococcus se destacaram nas atividades acidificante (∆pH 2,31 a 2,41U), proteolítica (0,6 a 0,79 mmol Gly), autolítica (11,69 a 16,64%) e aminopeptidásica. Cinco isolados de Lactococcus, no entanto, produziram aminas biogênicas (histamina) não sendo indicadas para integrarem um fermento lático. Das 12 cepas de Leuconostoc selecionados da coleção de BAL, seis apresentaram resultados importantes para as atividades acidificante (∆pH 0,73 a 1,12 U), proteolítica (0,28 a 0,32 mmol Gly), autolítica (8,95 a 11,81%), aminopeptidásica (Leu 0,02 a 0,12 U), produção de dextrano e nenhuma cepa produziu aminas biogênicas. Das 43 cepas de Lactobacillus avaliadas, duas apresentaram melhores resultados para as atividades acidificante (∆pH 1,53 e 1,68 U) e aminopeptidásica (Leu 0,45 e 0,47 U). Seis amostras produziram aminas biogênicas e não poderiam ser empregadas na formulação de fermentos. Os resultados obtidos permitiram conhecer os principais representantes da microbiota ácido lática associada ao queijo artesanal serrano, composta principalmente pelos gêneros Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc e Enterococcus. Dentre as cepas de BAL obtidas, as cepas Lactobacillus, Enterococcus e Leuconostoc apresentaram maior potencial antagônico contra bactérias patogênicas. Doze cepas (quatro Lactococcus, seis Leuconostoc e dois Lactobacillus) apresentaram potencial para o desenvolvimento de um fermento lático para a utilização na produção controlada de queijo Serrano, como inóculos puros ou mistos. Além disso, as amostras de queijo analisadas não atenderam as determinações sanitárias da legislação brasileira, indicando risco potencial de agravo à saúde pelo consumo deste produto pela população.Artisanal cheeses have been produced for centuries in Brazil. Each region in the country produces cheeses with their own sensorial and distinct characteristics. The informal manufacturing of the artisanal cheese in the city of Lages, in the state of Santa Catarina, is a very old practice and has great acceptance among different layers of society. The artisanal Serrano cheese, just like other artisanal cheeses, makes use of raw whole milk as raw material. The aim of this work was to identify the pathogenic lactic microbiota in the artisanal Serrano cheese, to characterize genetically the diversity of the aforementioned lactic microbiota, to evaluate its antagonistic potential to pathogens, as well as its technological characteristics to integrate a lactic starter culture.. Regarding the occurrence of pathogenic bacteria in the samples of Serrano cheese, Listeria monocytogenes was identified in three samples of the cheese, Staphylococcus positive coagulase in seven samples and 11 samples presented counts above the established by the legislation for the Escherichia coli. Salmonella spp. was not isolated in any of the samples analyzed. 543 strains of lactic acid bacteria (LAB) were obtained from the study of 20 samples of artisanal Serrano cheeses acquired at different points of sale city of Lages / SC. The strains were gathered according to the profiles of restriction fragmente intergenic polymorfim 16S-23S (RFLP PCR-ITS). Samples of these groups were selected for the sequencing of the 16S RNAr gene, which identified 268 (49,3%) strains of Lactobacillus, 208 (38,3%) of Lactococcus, 34 (6,3%) of Leuconostoc and 33 (6,1%) of Enterococcus. From the 543 strains of LAB analyzed, Lactobacillus spp. presented the greatest antagonistic potential to the Listeria monocytogenes. The Enterococcus spp. presented antagonism mainly against Escherichia coli and Salmonella Thyphimurium. The Leuconostoc genus presented greater antagonism to Staphylococcus aureus. Regarding the technological characteristics, 74 strains of LAB were selected randomly, but contemplating the three genera with technological potential, a total of 12 isolate Leuconostoc, 19 Lactococcus and 43 Lactobacillus. The strains of Lactococcus were evaluated for the acidifying, proteolytic, autolytic and aminopeptidase activities, production of biogenic amines, resistance to the NaCl and the temperature. The strains of Leuconostoc were evaluated for the acidifying, proteolytic, autolytic, aminopeptidase and lipolytic activities, production of biogenic amines, production of dextran, resistance to the NaCl and acidity. The strains of Lactobacillus were evaluated for the acidifying, proteolytic, autolytic, aminopeptidase and lipolytic activities, production of biogenic amines. Form the 19 strains of Lactococcus, 4 Lactococcus outstood in the acidifying (∆pH 2,31 to 2,41U), proteolytic (0,6 to 0,79 mmolGly), autolytic (11,69 to 16,64%) and aminopeptidase activities. Five isolates of Lactococcus, however, produced biogenic amines (histamine), therefore not being recommended to integrate a lactic starter culture. From the 12 selected strains of Leuconostoc from the LAB collection, six presented important results for the acidifying (∆pH 0,73 to 1,12 U), proteolytic (0,28 to 0,32 mmolGly), autolytic (8,95 to 11,81%), aminopeptidase (Leu 0,02 to 0,12 U) activities, production of dextran and no strain produced biogenic amines. From the 43 strains of Lactobacillus evaluated, two presented better results for the acidifying (∆pH 1,53 and 1,68 U) and aminopeptidase (Leu 0,45 and 0,47 U) activities. Six samples produced biogenic amines and could not be used in the production of starter culture. The results obtained allowed to get to know the main representatives of the lactic acid microbiota associated with the artisanal Serrano cheese, composed mainly by the Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc and Enterococcus genera. Among the strains of LAB obtained, the Lactobacillus, Enterococcus and Leuconostoc strains presented greater antagonistic potential against pathogenic bacteria.Ttwelve strains (four Lactococcus, six Leuconostoc and two Lactobacillus) showed to have potential for the development of a lactic starter culture to be used in the controlled production of Serrano cheese, applied as pure or mixed inoculums. Furthermore, the samples of cheese analyzed did not heed to the sanitary determinations of the Brazilian legislature, indicating potential risk of damage to the population’s health through the consumption of this product