Discriminação molecular de linhagens de Aspergillus niger sensu strico produtoras e não produtoras de ocratoxina A

A ocratoxina A (OTA), uma micotoxina com propriedades nefrotóxica e genotóxica, tem recebido destaque devido à freqüente contaminação de produtos destinados à alimentação. A OTA é sintetizada por espécies pertencentes aos gêneros Penicillium e Aspergillus, entre elas, Aspergillus niger, uma das espécies fúngicas de maior importância econômica devido a sua utilização industrial na produção de enzimas e ácidos orgânicos. A via de biossíntese da OTA ainda não foi completamente esclarecida para nenhuma espécie fúngica. Entretanto, o modelo proposto sugere que a enzima policetídeo sintase (PKS) está envolvida na formação de um dos precursores dessa micotoxina. Recentemente, o genoma de A. niger CBS 513.88 foi completamente seqüenciado e 34 open reading frames (ORF) para PKSs distintas foram descritas. Com o objetivo de identificar entre essas ORFs, um gene que pudesse discriminar linhagens de A. niger produtoras e não produtoras de OTA, investigamos no genoma dessa espécie, seqüências similares a genes que expressam enzimas PKS relacionadas com a biossíntese de OTA. A partir do gene pks previamente caracterizado em A. ochraceus, foi identificado no genoma de A. niger, com cerca de 80% de identidade com o gene pks, a ORF An15g07920 que codifica para uma suposta enzima PKS. Um par de primers construído a partir do gene An15g07920 foi utilizado para amplificá-lo em linhagens de A. niger produtoras e não produtoras de OTA, através da técnica de PCR. O amplicon foi verificado apenas em linhagens produtoras da toxina, indicando que esse gene não está presente em linhagens não produtoras de OTA. A técnica de Southern blot, utilizando como sonda um fragmento de 556pb da seqüência An15g07920, repetiu os resultados obtidos na PCR. O sinal de hibridação da sonda foi observado apenas em isolados ocratoxigênicos e confirmou a ausência do gene em linhagens de A. niger incapazes de sintetizar a micotoxina. A análise comparativa in silico entre o genoma de duas linhagens de A. niger (CBS 513.88 e ATCC 1015) revelou que a ORF An15g07920 está ausente na linhagem ATCC 1015, confirmando que este gene é específico para algumas linhagens. Através da análise por RT-PCR em tempo real foi possível verificar uma correlação positiva entre os transcritos do gene An15g07920 e a quantidade de OTA produzida por A. niger.Ochratoxin A (OTA), a mycotoxin with nephrotoxic and genotoxic properties, has received prominence due to frequent contamination of products destined to feeding. OTA is synthesized by species belonging to Penicillium and Aspergillus genus, among them, Aspergillus niger, one of the fungal species of great economic importance due to its industrial utilization in the production of enzymes and organic acids. The OTA biosynthetic pathway has not been completely elucidated yet for any fungal species. However, the proposed model suggests that the enzyme polyketide synthase (PKS) is involved in the formation of one of the precursors of this mycotoxin. Recently, the genome of A. niger CBS 513.88 has been completely sequenced and it was described 34 open reading frames (ORF) to distinct PKSs. With the aim to identify among these ORFs, a gene that could discriminate OTA producer and non producer A. niger strains, we investigated this specie genome for sequences that are similar to genes that express enzymes PKS related to OTA biosynthesis. From the pks gene previously characterized in Aspergillus ochraceus, was identified in A. niger genome, with 80% of identity with the pks gene, the ORF An15g07920 that codifies for a supposed PKS. A pair of primers constructed from the An15g07920 gene was used to amplify it in OTA producer and non-producer A. niger strains, through the PCR technique. Amplicon was verified only in mycotoxin producers?strains, indicating that this gene is not present in OTA non producers?strains. The technique of Southern blot, using as a probe a fragment of 556pb from the sequence An15g07920, repeated the results obtained in PCR. The probe hybridization signal was observed only in ochratoxigenic isolated and confirmed the absence of the gene in A. niger strains incapable of synthesizing the mycotoxin. The in silico comparative analysis between the genome of two A. niger strains (CBS 513.88 and ATCC 1015) showed that the An15g07920 ORF is absent in the ATCC 1015 strain, confirming that this gene is specific for some strains. Through the real time RT-PCR analysis it was possible to verify a positive correlation between the transcripts of the An15g07920 gene and the amount of OTA produced by A. niger