Purificação e caracterização dos inibidores de amilase em milho (Zea mays L.) visando controle de fusarium verticillioides

O milho (Zea mays L.) é uma cultura de interesse mundial envolvendo produção de 583 milhões de toneladas, sendo que o Brasil produz aproximadamente 7% do total. Devido as propriedades nutricionais, o milho está sujeito a diversos predadores com ênfase a insetos e fungos micotoxigênicos, destacando-se Fusarium verticillioides Niremberg (F. moniliforme Sheldon), por ser contaminante predominante de distribuição mundial, produtor de fumonisina na micoflora. Considerando que o controle de fungos em milho seja difícil, pesquisas estratégicas tem como alvo o estudo de compostos envolvidos nos mecanismos naturais de defesa das plantas, citando-se os inibidores de amilase (IA). Esta pesquisa contribuiu com o estudo dos mecanismos naturais de defesa com ênfase a inibidores contra amilase de F. verticillioides, assim como de insetos predadores relevantes na agricultura, visando o melhoramento genético do milho. A triagem de inibidores de amilase (IA) contra amilase de F. verticillioides foi realizada em 37 híbridos. O nível de IA variou de 5,5 a 16,0 unidades inibidoras de amilase (UIA/g) por grama de milho nos híbridos MASTER e AG5011, respectivamente. O híbrido com maior atividade inibidora de amilase foi utilizado na purificação da nova proteína por precipitação fracionada com (NH4)2SO4, cromatografia de filtração em gel (Sephadex G-75), Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) em coluna de Superose HR 10/30 e troca aniônica em CLAE, obtendo 20,7 vezes de purificação. A massa molecular aparente de 23,8 kDa foi determinada em SDS-PAGE sob condições redutoras com pI ácido de 5,4, diferindo de outros inibidores descritos em milho (14 e 22 kDa). O IA apresentou amplo espectro de atividade, inibindo amilase salivar e pancreática humana, de fungos como F. verticillioides e A. flavus, de insetos como A. obtectus, Z. subfasciatus, T. castaneum e S. cerealella. Fusarium spp. foi o principal contaminante do milho (81,1% das amostras) com contagem entre 1,5 x 102 a 2,4 x 106 ufc/g de milho, e fumonisina foi detectada em 21 híbridos com concentrações de 0,05 a 2,67 µg de FB/g de milho. No entanto, a correlação entre o nível de IA nos grãos de milho com a presença de Fusarium spp. e fumonisina nas condições experimentais avaliadas não foi significativa. Outro IA estudado apresentou alta hidrofobicidade com massa molecular de 19,7 kDa, foi purificado de milho procedendo extração com etanol a 95%, seguida de cromatografia de troca iônica. O IA ativo contra Fusarium verticillioides apresentou ponto isoelétrico de 3,6, estabilidade em ampla variação de pH e temperatura, mantendo 47,6% da atividade após tratamento a 94°C por 60 min. O IA purificado apresentou alto conteúdo de valina, leucina, glicina, alanina e glutamina/ácido glutâmico, com destaque especial ao teor de valina (41,2%). O inibidor não apresentou carboidrato na estrutura molecular e requereu 30 min de pré-incubação com amilase de F. verticillioides, para estabilizar o complexo enzima-inibidor. O pH ótimo de interação foi 6,5 e caracterizou-se com amplo espectro de ação, incluindo desde atividade sobre amilase salivar humana, pancreática de porco, F. verticillioides, a insetos de interesse agronômico (Acanthoscelides obtectus, Zabrotes subfasciatus, Sitophilus zeamais e Prostephanus truncatus). A nova proteína hidrofóbica demonstrou potencial de utilidade como marcadores moleculares de resistência fúngica, uma vez que também inibe a germinação de conídios de F. verticillioides, constituindo em alternativa promissora para minimizar a produção de fumonisina em milho. A comparação entre a microbiota fúngica, concentração de fumonisina e nível de IA contra amilase de F. verticillioides entre os 21 híbridos do grupo precoce e 16 de ciclo super precoce, não foi estatísticamente significativa (P > 0,05), sugerindo que maior ênfase deve ser dada às características inerentes do híbrido conforme interesse particular dos produtores, durante a escolha do ciclo a ser cultivado. Em suma, a atividade inibidora não se restringiu apenas a fungos micotoxigênicos relevantes no milho, mas também inibiu enzima de insetos de interesse agronômico, gerando novas perspectivas no estudo desta proteína contra resistência a predadores/fitopatógenos. I.e., desenvolvimento de plantas biotecnologicamente melhoradas, com a vantagem de não inibir as amilases de origem humana, aliada a baixa atividade sobre amilase de milho, arroz e cevada.Corn (Zea mays L.) is the main worldwide crop, producing 583 million tons, where Brazil produces 7% the total production with 50% destined for livestock feeding. Due the nutritional properties, the corn is attacked by several predators, with emphasis on Fusarium verticillioides Niremberg (F. moniliforme Sheldon), which is the main contaminant producing fumonisin in corn worldwide. The fungal control in corn is difficult, and research nowadays points the insertion into the area of natural mechanisms of plant defense, where the importance of amylase inhibitors has been concerned in corn. This work contributed in the study of natural mechanism of corn defense with emphasis on inhibitor against F. verticillioides amylase, as the insects of economical interest in agriculture. A screening for specific amylase inhibitor levels against amylase from F. verticillioides, was conducted on 37 corn hybrids. The amylase inhibitor levels in these hybrids ranged from 5.5 to 16.0 amylase inhibitor units (AIU/g) per gram of corn in the MASTER and AG5011 hybrids, respectively. The hybrid with the highest content of inhibitor was used as the source of this new protein. The inhibitor was partially purified using fractional precipitation, gel filtration on Sephadex G-75 column, HPLC Superose HR 10/30 column, and HPLC anion exchange chromatography, obtaining a 20.7-fold purification. Electrophoresis after denaturing and heating under reductive conditions showed an apparent 23.8 kDa molecular weight, and an acidic isoelectric point of 5.4, which differs from previous molecular weights reported for other inhibitors present in corn seeds (14 and 22 kDa). This inhibitor showed activity against amylases from human saliva and pancreas, from the fungi F. verticillioides, and A. flavus, and from the insects: A. obtectus, Z. subfasciatus, T. castaneum, and S. cerealela. The mycoflora found in the corn grain indicated Fusarium sp. as the most prevalent fungi (81.1% of the samples) with a count ranging from 1.5 x 102 to 2.4 x 106 CFU/g of corn. Fumonisins were detected in 21 out of the 37 hybrids studied, ranging from 0.05 to 2.67 µg of FB/g of corn. No correlation could be established between this amylase inhibitor level in the corn seeds and the presence of Fusarium sp. or with the fumonisin content under the experimental conditions of the test. Another AI studied was a hydrophobic 19.7 kDa amylase inhibitor (AI) was purified from corn kernels by 95% ethanol extraction and anionic exchange chromatography. The AI has a 3.6 isoelectric point, and was very stable at different pH and high temperatures, maintaining 47.6% activity heating at 94°C for 60 min. Its amino acid analysis showed high valine, leucine, glycine, alanine and glutamic acid/glutamine, with particular high content in valine (41.2 mol %). This inhibitor is not a glycoprotein and it showed a requirement of 30 min preincubation time to stabilize the complex enzyme-inhibitor, when the amylase from F. verticillioides was used. The optimal pH of interaction found, was 6.5. Its wide spectrum of activity includes the following amylases: human saliva, porcine pancreas, Fusarium verticillioides, as well as those from some insects of agronomical importance (Acanthoscelides obtectus, Zabrotes subfasciatus, Sitophilus zeamais and Prostephanus truncatus). This novel hydrophobic protein showed potential for its possible use as molecular marker for fungi resistance, since not only inhibited the amylase from F. verticillioides, but it also decreased the conidia germination, representing an alternative to decrease the production of fumonisin in corn crops. The correlation between corn mycoflora, fumonisin and AI level against amylase from F. verticillioides was not significant (P > 0.05), recommending the selection of corn essentially based on producer option. Summarizing, the AI activity did not restrict only against mycotoxigenic fungi, but it also inhibited the amylase of insect of agricultural interest, creating a new perspective for application on predators/phytopathogens. I.e., development of biotenologically modified plants using AI without activity on human amylase, in addition to low inhibition against amylases of corn, rice and barley origin