Diagnóstico molecular e análise de polimorfismos do gene S1 de estirpes brasileiras do coronavírus bovino em fezes diarreicas de bezerros naturalmente infectados

O coronavírus bovino (BCoV) é um importante agente etiológico de diarréia neonatal em bezerros. Usualmente, as técnicas para a detecção do BCoV limitam-se a métodos de baixa sensibilidade como ensaios imunoenzimáticos e testes de hemaglutinação (HA)/ inibição da hemaglutinação (HI). Embora a PCR seja altamente sensível e específica, a natureza da amostra biológica é um fator limitante no diagnóstico do BCoV, devido à presença de inibidores de PCR nas fezes que podem gerar resultados falso-negativos. A utilização de um controle interno na reação de PCR tem sido útil para monitorar a qualidade da extração e amplificação do ácido nucléico. Este trabalho teve como objetivo desenvolver um sistema de Semi nested-PCR (SN-PCR) para amplificação de um fragmento de 251 pares de bases (pb) do gene do nucleocapsídeo (N) do BCoV a partir de amostras fecais congeladas (n=25) e frescas (n=25) de bezerros com sinais clínicos de diarréia e naturalmente infectados. Para aperfeiçoar a detecção do BCoV em amostras fecais pela SN-PCR foi avaliada a inclusão de um controle interno e os resultados foram comparados com uma RT-PCR convencional descrita na literatura. O gene N do BCoV foi detectado pela SN-PCR e RT-PCR em respectivamente, 24% (12/50) e 8% (4/50) das amostras analisadas (K=0,43). Somente as amostras que não sofreram o congelamento foram positivas na RT-PCR enquanto a SN-PCR descrita neste trabalho detectou o BCoV em ambas condições de preservação. A possibilidade de resultados falso-negativos foi descartada com a amplificação do controle interno em todas as amostras analisadas. A inclusão de um controle interno na PCR possibilitou maior precisão no diagnóstico do BCoV como agente etiológico da diarréia em bezerros. Com o objetivo de estabelecer as relações genéticas entre as três estirpes brasileiras de BCoV daquelas descritas em outros países, foi desenvolvida uma estratégia de seqüenciamento para o gene que codifica a subunidade S1 da glicoproteína da espícula aplicando posteriormente o método da máxima parcimônia para realização das estimativas filogenéticas. A análise filogenética da seqüência total de nucleotídeos e dos aminoácidos deduzidos do gene S1 revelou que as estirpes brasileiras descritas neste trabalho apresentaram maior identidade com a estirpe entérica americana BCoV-ENT com 98,7% e 98,7%, respectivamente. A menor identidade foi observada com o protótipo BCoV Mebus com 97,8% (nucleotídeos) e 96,8% (aminoácidos). Na reconstrução da árvore filogenética não enraizada, baseada na região hipervariável da subunidade S1, nossas amostras foram agrupadas com as amostras americanas (BCoV-ENT, 182NS), amostras canadenses de diarréia neonatal (BCQ20, BCQ7373, BCQ2070, BCQ9, BCQ571, BCQ1523) e uma amostra canadense de diarréia do inverno (BCQ2590) e agruparam-se em um ramo separado das estirpes de origem coreana e as estirpes respiratórias de BCoV. Observou-se ainda que as três estirpes localizaram-se em um ramo bem distante de outras amostras brasileiras (AY606193, AY606194) anteriormente descritas. Portanto, estes dados colaboram com a reconstrução genealógica dos BCoV e sugerem a existência de no mínimo dois BCoV circulantes no Brasil. Adicionalmente o presente trabalho apresenta a descrição de uma mutação inédita na seqüência de aminoácidos observada no sítio de clivagem da proteína S. As prováveis conseqüências biológicas desta mutação foram especuladas a partir de estudos relacionados com o coronavirus da hepatite dos comundongos (MHV).Bovine coronavirus (BCoV) is an important infectious agent of neonatal diarrhea in calves worldwide. Currently, the routine detection and diagnosis of BCoV have been mainly dependent on assays with low sensitive as the enzyme-linked immunosorbent assay or hemagglutination (HA) / hemagglutination inhibition (HI) tests. Although PCR has been described as an assay with high sensitivity and specificity, the feces remains the most difficult clinical specimen for nucleic acid extraction and amplification due to the presence of PCR inhibitors that may yield false negative results. The use of an internal control in the PCR reaction has been most commonly applied to monitor and evaluate these failures. The aim of the present study was to develop and evaluate a semi-nested PCR (SN-PCR) to amplify a 251 base pairs (bp) fragment of BCoV N gene from fresh (n=25) and frozen (n=25) diarrheic fecal samples of naturally infected calves. To improve detection of BCoV in fecal samples by the SN-PCR an internal control was developed, and the results were compared with a conventional RT-PCR assay previously described in the literature. The rates of positive samples by SN-PCR and RT-PCR were respectively, 24% (12/50) and 8% (4/50) ((K=0,43). Only fresh samples were positive in RT-PCR while the SN-PCR detected BCoV in both storage conditions. The possibility of false negative results was excluded due to the internal control amplification in all samples analysed. The inclusion of an internal control provided more accurate diagnosis of BCoV as causative agent of diarrhea in calves. To verify genetic relationships among the three Brazilian strains of BCoV from other BCoV strains from different countries, was developed a sequencing strategy for the gene which codes spike glycoprotein S1 subunit and further phylogenetic analysis using maximum parsimony. The phylogenetic analysis of the entire S1 nucleotide and deduced amino acid sequences showed that BCoV Brazilian strains described in this study were more similar to the American enteric strain BCoV-ENT with 98.7% and 98.7%, respectively. The lower identity was observed with the BCoV Mebus strain with 97.8% (nucleotide level) and 96.8% (amino acid level). The phylogenetic unrooted tree based on hipervariable region of the S1 subunit, showed our strains clustered with American strains (BCoV-ENT, 182NS), Canadian calf diarrhea strains (BCQ20, BCQ7373, BCQ2070, BCQ9, BCQ571, BCQ1523) and an Canadian winter dysentery strain (BCQ2590) but clustered on a separate branch of the Korean and respiratory BCoV strains. Besides, it was described that BCoV strains of this study clustered in a separate branch of the previously published Brazilian strains (AY606193, AY606194). Therefore, these data corroborate to the genealogical construction and suggest the existence of at least two different BCoV strains circulating in Brazil. The present study also relates an exclusive mutation in the amino acid sequence of the S protein cleavage site. The probable biological effects of this mutation are discussed based on murine hepatitis coronaviruses (MHV) studies