Ocorrência de HLB e caracterização de 'Candidatus Liberibacter spp.' no estado do Paraná

Huanglongbing (HLB) é considerada a principal doença que ocorre na cultura de citros no mundo. Três espécies da bactéria são descritas como responsáveis pela doença, ‘Candidatus Liberibacter africanus’, ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ e ‘Candidatus Liberibacter americanus’. No Brasil, a doença foi detectada pela primeira vez em 2004, no estado de São Paulo. No Paraná, a primeira ocorrência da doença foi observada em 2006 no município de Altônia, na região Noroeste do Estado. Os objetivos desse trabalho foram avaliar a incidência do HLB em regiões citrícolas do estado do Paraná, estudar a diversidade genética de ‘Ca. Liberibacter asiaticus’ presente nessas regiões, bem como obter isolados da bactéria em meio de cultura. Foram avaliadas folhas com sintomas suspeitos de HLB utilizando-se o teste da PCR com ‘primers’ específicos para as três espécies de ‘Ca. Liberibacter’. Para o estudo de diversidade genética, foram utilizadas as técnicas de PCR-RFLP com as enzimas de restrição ApoI, HinfI e TaqI e sequenciamento dos genes omp e rplAJ. No isolamento de ‘Ca. Liberibacter asiaticus’ foram utilizados ramos de plantas de laranja doce cv. Valência enxertadas sobre limão Cravo e também plantas de pé-franco da mesma cultivar, infectadas artificialmente. Para extração da seiva foi utilizada bomba de pressão de Scholander, onde os ramos foram submetidos a uma pressão de 3,0 megapascal e a seiva extraída foi coletada e plaqueada sobre os meios de cultura BCYE, PD2+E e LiberA sem adição de NADP. As placas foram mantidas em câmara de crescimento a 28 ºC até o desenvolvimento de colônias bacterianas. O levantamento da ocorrência de HLB foi realizado no período de agosto de 2007 a agosto de 2011, onde 728 amostras de citros foram examinadas. Destas amostras, 61,5% apresentaram resultado positivo para ‘Ca. Liberibacter asiaticus’, sendo essa a única espécie detectada associada ao HLB. Foram avaliadas amostras de citros provenientes de 192 pomares de 47 municípios das regiões Norte, Noroeste e Oeste do Estado. O HLB foi constatado em amostras de 37 municípios. A doença foi diagnosticada em laranja Pêra (50,0%), Valência (17,7%), Iapar 73 (16,0%) e Folha Murcha (9,2%). Do total de amostras positivas para HLB, 61,30% foram detectadas em copas de laranjas doce enxertadas sobre o porta-enxerto limão Cravo. Plantas com idade entre 6 e 10 anos foram as mais avaliadas, correspondendo a 34% do total de amostras positivas. Não foi observada diversidade genética entre as amostras paranaenses da bactéria do HLB, tanto pela técnica de PCR-RFLP como por sequenciamento para os dois genes analisados. A similaridade genética observada da bactéria que ocorre no Paraná com amostras de outras regiões citrícolas foi de 99 a 100%. A presença de ‘Ca. Liberibacter asiaticus’ em colônias bacterianas desenvolvidas no meio de cultura PD2+E foi confirmada por PCR e sequenciamento com ‘primers’ específicos para esta bactéria. Porém, o sequenciamento do produto de PCR obtido com ‘primers’ genéricos também revelou similaridade de 99% com bactérias não culturáveis e bactérias do gênero Paenibacillus, indicando que ‘Ca. Liberibacter asiaticus’ pode estar em associação com outras bactérias nessas colônias bacterianas.Huanglongbing (HLB) is considered the most important disease for citrus production around the world. Three bacteria species are associated with HLB, ‘Ca. Liberibacter africanus’, ‘Ca. Liberibacter asiaticus’ and ‘Ca. Liberibacter americanus’. In Brazil, the disease was first reported in 2004, in the State of São Paulo. In Parana, HLB was reported for the first time in 2006, in the municipality of Altonia, in the Northeast region of the State. The objectives of this work were to verify the occurrence of the disease in different citrus growing areas of Parana, to study the genetic diversity of the bacterium present in the State, as well as to establish isolates of the bacterium in pure culture. Leaf samples from plants suspected to have HLB were examined by PCR with specific primers for the three species of ‘Ca. Liberibacter’. The study of the genetic diversity of the HLB bacterium present in Parana was carried out by PCR-RFLP using the restriction enzymes ApoI, HinfI e TaqI, and sequence analysis of the omp e rplAJ genes. For the isolation of ‘Ca. Liberibacter asiaticus’, branches of sweet Orange trees of cv. Valencia grafted onto Rangpur lime, as well non-grafted trees of the same cultivar were used. Sap was extracted by using the Scholander pressure pump. Fresh cut branches were subject to 3,0 mpascal of pressure and the sap was collected and plated onto the media BCYE, PD2+E e LiberA without addition of NADP. The Petri plates were kept in growth chamber at 28 ºC. The HLB survey was carried out during the period of August 2007 through August 2011. A total of 728 samples were examined, and 61.5% showed positive results for ‘Ca. Liberibacter asiaticus’. “Ca. Liberibacter asiaticus’ was the only species associated with HLB in Parana. Samples were collected from 192 orchards, comprising 47 municipalities of the North, Northeast and West regions of the State. HLB was detected in samples from 37 municipalities. In regard to citrus cultivars, HLB was detected in the sweet oranges Pera (50,0%), Valencia (17,7%), Iapar 73 (16,0%) and Folha Murcha (9,2%). Among the samples with positive results for HLB, 61.30% was of sweet Orange trees grafted onto Rangpur lime. The age of the citrus trees ranged from 0 to 20 years old, thus 34% of the samples were from trees 6 to 10 years old. HLB bacteria present in Parana did not show any genetic variability based on PCR-RFLP and sequencing analysis. The genetic similarity of the bacteria present in Parana was 99 to 100% similar to ‘Ca. Liberibacter asiaticus’ from other citrus growing areas. The presence of ‘Ca. Liberibacter asiaticus’ in bacterial colonies developed on PD2+E media was confirmed by PCR and sequence analysis. However, the presence of other bacteria 99% similar Paenibacillus spp. was determined by the sequence analysis of the 16S rDNA. These results indicated the possible association of ‘Ca. Liberibacter asiaticus’ with other bacteria in culture