Variabilidade genética de Beauveria bassiana e desenvolvimento de Marcador Isolado-Específico

Um dos problemas da cultura da banana é a presença de pragas que limitam a produção e afetam a qualidade dos frutos. Dentre as pragas dessa cultura destaca-se o Cosmopolites sordidus (coleóptera Dryophthoridae). A utilização do fungo entomopatogênco Beauveria bassiana como agente de controle biológico de C. sordidus pode contribuir para a redução do uso de inseticidas químicos. Para o desenvolvimento de produtos a base de B. bassiana é importante o conhecimento da variabilidade genética da espécie e a seleção de isolados mais efetivos para ocontrole da praga de interesse. Da mesma forma, o desenvolvimeto de marcadores isolados-específicos é de importância para o monitoramento de persistência e comportamento de um isolado em campo. O objetivo desta dissertação foi avaliar a variabilidade genética de B. bassiana e desenvolver um marcador isolado-específico para detecção e monitoramento em campo. Para tanto, foi realizada a análise de Polimorfismo de DNA Amplificado ao Acaso (RAPD) e análise de Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos Amplificados (AFLP) de 42 isolados de Beauveria bassiana, obtidos de diversas regiões geográficas do Brasil e de diferentes hospedeiros da família Dryophthoridae. A partir dos fingerprints de DNA gerados pelas técnicas RAPD e AFLP obteve-se, respectivamente 92% e 88% de locos polimórficos. Os isolados de B. bassiana foram atribuídos a 2 clusters genotípicos quando considerados os dados de RAPD, e 3 clusters genotípicos quando analisados por AFLP. O sequenciamento da região ITS1-5,8S-ITS2 do cluster de DNA ribossomal permitiu identificar que os isolados pertencem ao clado A de B. bassiana. A análise da variância molecular (AMOVA), também realizada separadamente para os dados gerados por RAPD e AFLP, mostrou que a variabilidade entre os isolados não está correlacionada com a origem geográfica ou com os hospedeiros. Um marcador de RAPD específico para o isolado CG 1024 foi clonado e sequenciado. A partir das sequências obtidas foram desenhados primers PCR específicos 1024F838 (5’TGC GGC TGA GGA GGA CT 3’) e 1024R838 (5’ TGC GGC TGA GTG TAG AAC 3’), para detecção e monitoramento do referido isolado em campo.One of the problems experienced in banana cultivation is the presence of pests that limit production and harm fruit quality. Banana pests include the weevil Cosmopolites sordidus (Dryophthoridae). The use of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana as a biological control agent for C. sordidus can contribute to reducing the use of chemical pesticides in banana crops. In order to develop B. bassiana-based products, it is important to know the genetic variability of the species and to select the most effective isolates to control the pest. Likewise, the development of isolate-specific markers is important for monitoring the persistence and behavior of an isolate in the field. The aim of this dissertation is to assess the genetic variability of B. bassiana and develop an isolate-specific marker for field inspection and monitoring. Accordingly, RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA) and AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) analyses were carried out on 42 B. bassiana isolates, obtained from various regions of Brazil and different hosts of the Dryophthoridae family. Based on the DNA fingerprints generated using the RAPD and AFLP techniques, polymorphic loci of 92% and 88%, respectively, were obtained. The B. bassiana isolates were divided into two genotype clusters when the RAPD data were considered, and into three genotype clusters when analyzed using AFLP. By sequencing the ITS1-5,8S-ITS2 region of the ribosomal DNA cluster, it was found that all the isolates belong to clade A of B. bassiana. An analysis of molecular variance (AMOVA), also conducted separately for the data generated by RAPD and AFLP, showed that the variability between the isolates is not correlated with geographical origin or hosts. A specific RAPD marker for isolate CG 1024 was cloned and sequenced. Based on the sequences obtained, specific PCR primers 1024F838 (5’TGC GGC TGA GGA GGA CT 3’) and 1024R838 (5’ TGC GGC TGA GTG TAG AAC 3’) were designed to detect and monitor the respective isolate in the field