Efeitos genotóxicos e citotóxicos do herbicida glifosato e do produto formulado Roundup Transorb® para um peixe neotropical : testes in vivo e in vitro

Este trabalho foi desenvolvido para investigar se o glifosato e seu produto formulado o herbicida Roundup Transorb® (RT) causam danos à molécula de DNA do peixe Prochilodus lineatus por meio de testes in vivo e in vitro. Nos ensaios in vivo foram utilizados o ensaio do cometa (em eritrócitos e células branquiais), o teste do micronúcleo e outras alterações eritrocíticas nucleares (AEN). Nos ensaios in vitro realizados com eritrócitos, além do ensaio do cometa, foram utilizados o ensaio de difusão do DNA para avaliar a ocorrência de apoptose e necrose, produção de espécies reativas de oxigênio (ERO), avaliação da capacidade antioxidante (CAO) e o tempo de retenção do vermelho neutro (TRVN). Nos testes in vivo foram utilizados juvenis de P. lineatus expostos a duas concentrações (1 e 5 mg.L-1) de glifosato e RT ou apenas à água desclorada (controle negativo ou CN), durante 6, 24 e 96 h. Para os testes in vitro foram utilizados eritrócitos da mesma espécie de peixe expostos às mesmas concentrações dos dois agroquímicos, nos tempos de 1, 3 e 6 h. Como controle negativo (CN) foram utilizadas células expostas apenas à solução salina. Os resultados do ensaio do cometa obtidos nos testes in vivo mostraram que os eritrócitos dos peixes expostos ao glifosato, por 6 e 96 h, e ao RT, por 24 e 96 h, nas duas concentrações, apresentaram escore de danos no DNA significativamente maior que os respectivos CN. Para as células branquiais o glifosato foi genotóxico apenas após 6 h, na maior concentração, e o RT apenas em 24, nas duas concentrações testadas. No teste do micronúcleo tanto o glifosato quanto o RT não induziram a ocorrência de MN nos eritrócitos, tão pouco a ocorrência de outras AEN foi significativamente maior que no CN. Assim, tanto o glifosato quanto o RT causaram danos à molécula de DNA de P. lineatus, mas de forma mais acentuada nos eritrócitos do que nas células branquiais. Por outro lado, o princípio ativo e o produto formulado não exerceram efeito mutagênico no DNA dos eritrócitos. Os resultados do ensaio do cometa dos testes in vitro revelaram aumento significativo no escore de danos, em relação ao CN, após 1 h de exposição na menor concentração de glifosato, e nos três tempos de exposição às duas concentrações de RT. O ensaio que detecta a produção de ERO mostrou aumento de ERO e da CAO, em relação ao CN, após 1 h de exposição à 1mg.L-1 de glifosato e aumento de ERO e diminuição da CAO, também em comparação ao CN, após 1 h de exposição à 5mg.L-1 de RT. As análises do ensaio de difusão do DNA não revelaram aumento da ocorrência de células apoptóticas e/ou necróticas nos grupos expostos do glifosato e ao RT. E o TRVN mostrou diminuição da estabilidade dos lisossomos expostos a 5 mg.L-1 de glifosato após 3 e 6 h e às duas concentrações de RT a partir de 1 h. Os resultados do ensaio do cometa mostraram que o RT tem um efeito maior sobre os eritrócitos de P. lineatus, quando comparado com seu princípio ativo. Os danos no DNA não devem ter apenas origem oxidativa, porque os resultados obtidos pelo TRVN sugerem que eles podem ter relação com as enzimas liberadas no interior da célula devido à desestabilização dos lisossomos. Entretanto, esses danos não foram suficientes para induzir morte por apoptose/necrose, sugerindo a atuação do sistema de reparo. O uso integrado de testes in vivo e in vitro, juntamente com as técnicas empregadas neste trabalho, demonstrou ser uma valiosa ferramenta para a compreensão dos mecanismos de toxicidade do glifosato e do RT sobre a molécula de DNA do P. lineatus.This study was designed to investigate whether glyphosate and its commercial formulation Roundup® Transorb (RT) can damage the DNA molecule of the fish Prochilodus lineatus by using in vivo and in vitro tests. In the in vivo assays, the comet assay (in gill cells and erythrocytes), the micronucleus test and the analysis of other erythrocyte nuclear abnormalities (ENA) were applied. The in vitro tests were carried out with fish erythrocytes, and in addition to the comet assay, it was was performed the DNA diffusion assay, to evaluate the occurrence of apoptosis and necrosis, and assays to determine the production of reactive oxygen species (ROS), the total antioxidant capacity (AC) and the neutral red retention time (NRRT). In vivo tests were performed with juveniles of P. lineatus exposed to two concentrations (1 and 5 mg.L-1) of glyphosate and RT or only to dechlorinated water (negative control or CN) for 6, 24 and 96 h. In vitro tests were developed using the erythrocytes exposed to the same concentrations of both herbicides, during 1, 3 and 6 h. For the negative control (NC) cells were exposed only to saline. The results of the comet assay obtained in the in vivo tests showed that the erythrocytes of fish exposed to both concentrations of glyphosate, for 6 and 96 h, and of RT, for 24 and 96 h, showed a score of DNA damage significantly higher than their respective NC. For the gill cells a significant increase in the score of DNA damage was observed only after 6 h exposure to the highest glyphosate concentration and after 24 h exposure to both RT concentrations. The results of the micronucleus test showed that both glyphosate and RT concentrations did not induce MN and the occurrence of other ENA was not significantly higher than NC. Thus, both RT and glyphosate caused damage to the DNA of P. lineatus, which was more evident in erythrocytes than in gill cells. Moreover, the active ingredient and the formulated product did not produce mutagenic effect on the DNA of both cell types. The results of the comet assay of the in vitro tests revealed a significant increase in the score of DNA damage, when compared to the NC, after 1 h of exposure to the lower glyphosate concentration, and at the 3 exposure periods to both concentrations of RT. The test which detects ROS production showed a significant increase in ROS generation and in AC, in relation to NC, 1 h after exposure to 1mg.L-1 of glyphosate, and increased ROS and reduced AC, also in comparison to NC, after 1 h of exposure to 5 mg.L-1 of RT. The analysis of the DNA diffusion assay did not reveal any increase in the occurrence of apoptotic and necrotic cells in the groups exposed to glyphosate or RT. The NRRT showed a decrease in the stability of lysosomes of the cells exposed to 5 mg.L-1 of glyphosate, after 3 and 6 h, and to both concentrations of RT, after 1, 3 and 6 h. The results of the comet assay showed that RT has a greater effect on the erythrocytes of P. lineatus, when compared with its active ingredient. The DNA damage observed was not only from oxidative origin, because the results obtained by the NRRT suggest that they may be related to the enzymes released into the cell due to the destabilization of lysosomes. However, these damages were not sufficient to induce apoptosis/necrosis, suggesting an efficient repair system. The integrated use of in vivo and in vitro, together with the techniques employed in this work, has proved to be a valuable tool for understanding the mechanisms of toxicity of glyphosate and RT on the DNA molecule of P. lineatus