Partial purification of biologicaly active compounds from Pycnoporus sanguineus for the control of soybean asian rust

A induÃÃo de resistÃncia envolve a ativaÃÃo de mecanismos de defesa latentes existentes nas plantas em resposta ao tratamento com agentes biÃticos ou abiÃticos. A aplicaÃÃo de extratos brutos visando à induÃÃo de mecanismos de resistÃncia à uma alternativa interessante ao controle quÃmico, entretanto, nestes extratos pode ocorrer alÃm da presenÃa de indutores, a presenÃa de supressores. Este trabalho teve por objetivo a purificaÃÃo parcial, por meio de cromatografia de filtraÃÃo em gel (CFG) e precipitaÃÃo com sulfato de amÃnio (SA), de compostos presentes em extrato bruto de Pycnoporus sanguineus, eficientes no controle de ferrugem asiÃtica em soja por induÃÃo de resistÃncia. Extrato bruto de P. sanguineus foi submetido à cromatografia de filtraÃÃo em gel, sendo obtidos cinco picos protÃicos e um pico glÃcido, com pesos moleculares variando de 1,82 a 5,18 KDa. Foi efetuada a precipitaÃÃo fracionada das proteÃnas presentes em 100 mL de extrato bruto de basidiocarpos de P. sanguineus. As fraÃÃes obtidas foram: 0-20%, 20-40%, 40-60%, 60-80% e 80-100% de SA. CotilÃdones de soja incisados foram tratados com as fraÃÃes provenientes da CFG e precipitaÃÃo com SA, alÃm dos tratamentos extrato bruto a 20% (EB 20%), Saccharomyces cerevisiae (25 mg mL-1) e Ãgua. ApÃs incubaÃÃo pelo perÃodo de 20 h efetuou-se anÃlises bioquÃmicas dos cotilÃdones para verificar os teores de fitoalexinas, peroxidases, polifenoloxidases, β-1,3 glucanases e fenilalanina amÃnia-liase. Os tratamentos obtidos por CFG fraÃÃes protÃicas III (3,44 KDa), IV (2,79 KDa) e V (1,82 KDa), e glÃcida, alÃm das fraÃÃes 40-60, 60-80 e 80-100% obtidos por saturaÃÃo com SA foram selecionados para avaliaÃÃo de atividade antimicrobiana e de induÃÃo de resistÃncia em soja contra P. pacchirhizi em casa de vegetaÃÃo, utilizou-se tambÃm extrato bruto (EB) 20% de basidiocarpo de P. sanguineus e as testemunhas fungicida tebuconazole (0,5 g i.a. L-1) e Ãgua. Visando avaliar o controle da doenÃa ferrugem asiÃtica e induÃÃo de enzimas relacionadas à defesa, montou-se ensaio em casa de vegetaÃÃo onde plantas foram tratadas e apÃs trÃs dias inoculadas com o patÃgeno. Amostras foram coletadas 0, 1, 3, 6 e 9 dias apÃs os tratamentos para anÃlises bioquÃmicas e a severidade foi avaliada apÃs 13 dias. Os dados referentes à avaliaÃÃo de atividade antimicrobiana mostram que as fraÃÃes nÃo possuem atividade inibidora da geminaÃÃo de esporos. Quanto à severidade, a fraÃÃo III e o EB 20% foram eficientes na reduÃÃo do nÃmero de lesÃes por cm2. Para peroxidases, o EB 20% apresentou tendÃncia em reduzir a atividade enzimÃtica. Quitinases e polifenoloxidases nÃo apresentaram diferenÃas estatÃsticas entre os tratamentos. Para β-1,3 glucanases houve induÃÃo local pelas fraÃÃes glÃcida e protÃicas III e V, e pelas fraÃÃes 40-60% e 60-80% em relaÃÃo ao EB 20%, sendo que o mesmo apresentou induÃÃo sistÃmica para essa enzima. Para fenilalaniana amÃnia-liase as fraÃÃes purificadas de P. sanguineus apresentaram tendÃncia em reduzir a atividade enzimÃtica, com exceÃÃo para EB 20%. Foi possÃvel induzir mecanismos de defesa em soja contra P. pachyrhizi pela aplicaÃÃo de fraÃÃes parcialmente purificadas de P. sanguineus, o que pode permitir o desenvolvimento de mÃtodos alternativos para controle desse patÃgenoInduced resistance involves the activation of latent defense mechanisms in plants in response to the treatment with biotic or abiotic agents. The use of crude extracts aimed at inducing resistance mechanisms is an interesting alternative to chemical control, however, in this extracts can occurs besides de presence of inducers, the presence of suppressors. This work objectived a partial purification, through gel filtration chromatography (GFC) and by ammonium sulphate (AS) precipitation, of compounds in basidiocarps crude extracts from Pycnoporus sanguineus efficient to the control of Asian rust in soybean by induction of resistance. Crude extracts from P. sanguineus were submited to gel filtration chromatography (GFC), and five proteins and one carbohydrate peaks were obtained, with molecular weight ranging from 1,82 to 5,18 KDa. It was made the fractionated protein purification from 100 mL of crude extract from P. sanguineus. The fractions obtained were: 0-20%, 20-40%, 40-60%, 60-80% and 80-100% of ammonium sulphate. Incised soybean cotyledons were treated with fractions from GFC and AS precipitation, crude extract 20% (EB 20%), Saccharomyces cerevisiae (25 mg mL-1) and water. After incubation during 20 h, was made biochemical analyses to verify the phytoalexins content and peroxidases, polyphenoloxidases, β-1,3 glucanases and phenylalanine ammonia-lyase activities. The treatments from GFC, protein fractions III (3,44 KDa), IV (2,79 KDa) and V (1,82 KDa), and carbohydrate fraction, fractions 40-60%, 60-80% and 80-100%, obtained by ammonium sulphate precipitation, crude extract (CE) of basidiocarps at 20%, besides control treatments fungicide (tebuconazole, 0,5 g a.i. L-1) and water were used to evaluate the antimicrobial activity and induction of resistance in soybean against P. pacchirhizi in greenhouse. Soybean plants were treated and after three days were inoculated with the pathogen. Samples were collected 0, 1, 3, 6 and 9 days after the treatment for biochemical analyses and the severity was evaluated after 13 days. The data referring to evaluation of antimicrobial activity show that the fractions do not have inhibiting activity of germination of spores. As for severity, the treatments protein fraction III and CE 20% were efficient in the reduction of the number of injuries for cm2. For peroxidase the CE 20% presented tendency in reducing the enzymatic activity. Chitinases and polifenoloxidases did not presented statistical differences between the treatments. For β-1,3 glucanases there was local induction for the treatments with glicide fraction and protein fractions III and V, and fractions 40-60% and 60-80%, while CE 20% presented systemic induction for this enzyme. For phenylalanine ammonia-lyase the purified fractions of P. sanguineus reduced the enzymatic activity, except for CE 20%. It was possible to induce defense mechanisms in soybean against P. pachyrhizi for the application of partially purified fractions from P. sanguineus, indicating its possible use as an alternative method for controling this pathoge