Development of an in vitro biofilm model for enamel demineralization studies

Os objetivos deste estudo foram avaliar a desmineraliza????o do esmalte em resposta a condi????es cariog??nicas induzidas por diversos regimes de exposi????o a sacarose em um modelo de biofilme de microcosmos, e verificar se o modelo testado apresentaria efeito dose-resposta ao tratamento com clorexidina. Os biofilmes de microcosmo foram originados de saliva e crescidos sobre discos de esmalte bovino em placas de micropo??os. Foi utilizado um meio definido enriquecido com mucina (DMM), suplementado com concentra????es de sacarose que variaram de 0,075% a 1%, sob regimes de exposi????o cont??nua – modelo est??tico, ou intermitente – modelo semi-din??mico (40min a 6h de exposi????o). As placas foram incubadas em condi????o de anaerobiose por at?? 10 dias sob temperatura controlada de 37??C. As trocas dos meios foram realizadas diariamente. A acidogenicidade dos biofilmes foi obtida atrav??s de leituras de pH dos sobrenadantes no meio; as altera????es/ perda de dureza na superf??cie do esmalte (%PDS) foram calculadas atrav??s de leituras de dureza superf??cial do esmalte antes e ap??s os tratamentos. Os resultados indicaram que a acidogenicidade decorrente dos diferentes regimes de exposi????o a sacarose afetaram a dureza superficial do esmalte.A dureza do esmalte n??o foi alterada sob exposi????o a baixa concentra????o de sacarose (est??tico-0,075%). O %PDS do esmalte sob exposi????es de 0,15% de sacarose no meio foram tempo-dependentes; a perda mineral foi significativa no regime est??tico, enquanto que no regime semidin ??mico (6h) n??o houve altera????o de dureza significativa. Em concentra????es de 0,5% de sacarose este efeito tempo-dependente para exposi????o tamb??m foi observado na altera????o de dureza do esmalte. Exposi????es de 40min a 3h de sacarose no meio (at?? 10 dias) n??o induziram um %PDS significativo em esmalte. Contudo, com o aumento do tempo de exposi????o para 6h uma perda mineral significativa foi observada em esmalte. Ainda, com 0,5% em regime est??tico, a perda mineral foi severa, comprometendo a integridade da superf??cie do esmalte, independentemente dos per??odos de exposi????o avaliados (4, 7 e 10 dias). A eros??o da superf??cie nesta condi????o excluiu a possibilidade de avaliar o %PDS, sugerindo que a exposi????o a um pH baixo (4.3), mantido de forma constante, promoveria les??es de eros??o no lugar de les??es subsuperficiais de c??rie. As exposi????es de 0,5% e 1% de sacarose no regime semi-din??mico (6h) induziram um %PDS significativo em esmalte. A avalia????o de dose-resposta do modelo foi realizada em um regime - semi-din??mico 1% de sacarose. Ap??s 24h de crescimento dos biofilmes, foi realizado o tratamento com solu????o de clorexidina em concentra????es que variaram de 0,012 a 0,12% ou com um controle (solu????o salina est??ril) durante 1 min. O tratamento foi aplicado antes do desafio com sacarose durante 3 dias. Verificou-se que a acidogenicidade dos biofilmes e as altera????es de dureza do esmalte foram dose-dependentes aos tratamentos com clorexidina. Como conclus??o, dentro das limita????es de estudos laboratoriais, o modelo de biofilme foi capaz de responder aos diferentes n??veis de desafios cariog??nicos e demonstrar um efeito de dose-resposta a clorexidina, sendo apropriado para utiliza????o como um modelo pr??-cl??nico para testar o potencial anticariog??nico de tratamentos e para estudos desmineraliza????oThe aims of this study were to evaluate enamel demineralization response to cariogenic conditions induced by several sucrose regimens in microcosm biofilms, and to test the model with a dose-response evaluation to chlorhexidine. Microcosm biofilms derived from plaque enriched saliva were grown on bovine enamel discs in multi-well plates fed with defined medium enriched with mucin (DMM), which was supplemented with sucrose concentrations that ranged from 0.075% to 1%. Sucrose exposure occurred all day in batch culture or in a semi-continuous fed (40 min to 6h). Plates were incubated anaerobically for up to 10 days at 37??C. DMM was replaced daily. Data from acidogenicity of biofilms were collected as pH readings from medium supernatants and the percentual surface hardness change (%SHC) was obtained by enamel surface hardness readings before and after treatments. The results from sucrose regimens indicated that acidogenicity of biofilms affected, enamel surface hardness. Under low sucrose concentration exposures (batch- 0.075%) enamel hardness was not affected. Exposures to 0.15% sucrose were timedependent, as enamel surface experienced mineral loss in batch but not in semicontinuous (6 h) fed. With 0.5% sucrose concentration a time-dependent exposure effect was also observed in enamel hardness change.Exposures from 40 min to 3 h sucrose-fed (up to 10 days) did not caused significant %SHC in enamel, but increasing the exposure time to 6 h induced significant mineral loss. Under 0.5%- batch severe damage to enamel surface was noted, irrespective of the time-points evaluated (4, 7 and 10 days). The resulting eroded surfaces excluded the possibility of SH evaluation, and suggested that the constant low pH (4.3) would promote erosion lesions instead of subsurface carious lesions. Exposures to 0.5% and 1% in 6 h sucrose-fed induced significant %SHC in enamel. The dose-response evaluation was performed in one regimen - semi-continuous 1% sucrose. After 24h of grown, biofilms were treated with chlorhexidine in concentrations that ranged from 0.012 to 0.12% or a control (sterile saline solution) during 1 min. Treatment was applied before sucrose-fed for 3 days. Biofilm acidogenicity and the changes in enamel hardness were dose-responsive to chlorhexidine treatments. In conclusion, within the limitations of laboratorial studies the biofilm model assessed promoted doseresponse effect to chlorhexidine and to different sucrose feeding protocols, being suitable as a pre-clinical model for testing the anticariogenic potential of treatments and for demineralization studie