Selection of swine oocytes through Brilliant Cresyl Blue

Para a obten????o de embri??es su??nos produzidos in vitro faz-se necess??rio que a matura????o in vitro (MIV) ocorra de forma eficiente, o que exige a sele????o dos complexos cumulus-o??citos (CCOs) mais competentes. O corante Brilliant Cresyl Blue (BCB) permite selecionar os CCOs que completaram seu crescimento, mediante a avalia????o dos n??veis da enzima G6PDH. Entretanto, existe um poss??vel efeito nocivo relacionado ao processo de sele????o com BCB, o qual pode ser devido a uma toxicidade intr??nseca do corante ou aos v??rios fatores relacionados ?? composi????o dos meios para a realiza????o do teste. Desta forma, esta pesquisa teve como objetivos: averiguar a exist??ncia de toxicidade ap??s exposi????o ao BCB e avaliar o efeito de diferentes meios para a colora????o com BCB sobre a capacidade de suporte ao desenvolvimento oocit??rio. Na primeira pesquisa, ap??s a colora????o com BCB e ap??s a MIV, v??rios testes foram realizados para avaliar os efeitos de sua potencial toxicidade sobre a atividade e a funcionalidade mitocondrial: an??lises de esp??cies reativas de oxig??nio (ROS), ATP, potencial de membrana mitocondrial e n??mero de c??pias de DNA mitocondrial. Como resultados, obteve-se que o??citos corados com BCB produziram altos n??veis de ROS quando comparados com o controle imediatamente ap??s a colora????o e ap??s a MIV. O ATP e potencial de membrana mitocondrial apresentaram resultado similar entre os grupos ap??s a colora????o, por??m, ap??s a MIV o??citos BCB apresentaram menor potencial de membrana e ATP. N??o ocorreu diferen??a no n??mero de c??pias do DNAmt nos grupos avaliados. J??, no teste do conte??do de ATP em embri??es iniciais, o ATP foi inferior em o??citos BCB, por??m, n??o ocorreu diferen??a significativa. Na segunda pesquisa, comparou-se o meio mais utilizado, D-PBS, com um meio mais elaborado para o BCB, chamado de ReproPEL. Os CCOs submetidos aos dois meios foram submetidos ?? MIV e avaliados quanto ?? matura????o nuclear e citoplasm??tica, ativa????o partenogen??tica e ao teste cometa. Na MIV nuclear, as maiores taxas de MII (P<0,05) foram obtidas no DPBS+ (63,1%), ReproPELc (55,1%) e ReproPEL+ (50,2%). Quanto ?? densidade dos GC, os grupos com menor ??rea (P<0,05), evidenciando melhor migra????o, foram ReproPELc, D-PBS+, D-PBS- e ReproPEL+. A ativa????o partenogen??tica demonstrou que o meio ReproPEL possui boa capacidade de manuten????o oocit??ria, possibilitando taxas aceit??veis de desenvolvimento at?? o est??gio de blastocisto: ReproPEL+ (13,0%); e ReproPELc (12,7%). Desta forma, o meio ReproPEL pode ser indicado para a manuten????o oocit??ria, por??m n??o foi o meio mais indicado para o corante BCB. Com rela????o ?? toxicidade, ap??s a exposi????o ao BCB e ap??s a MIV, os o??citos BCB apresentaram altera????es em n??vel mitocondrial, devido ao aumento na produ????o de ROS, diminui????o do potencial de membrana e ao comprometimento da produ????o de ATP. Por??m, a fun????o mitocondrial foi restaurada no in??cio do desenvolvimento embrion??rio. Com tudo isso, conclui-se que o BCB foi respons??vel por toxicidade em o??citos su??nos imaturos, sendo necess??rios novos estudos para avaliar as altera????es causadas pelo BCB em n??vel embrion??rio.The production of swine embryos in vitro requires efficient in vitro maturation (IVM), which can be achieved by selection the most competent cumulus-oocyte complexes COC).The Brilliant Cresyl Blue (BCB) dye allows the selection of COC with complete growth by assessing their levels of the G6PDH enzyme. However, there is a possible negative effect of selection with BCB. This effect may be due to its intrinsic toxicity or to factors related to the composition of the media used during the test. This research had the objectives: to determine potential toxicity after exposure to BCB and to evaluate the effect of different medias for BCB staining on the ability to support oocyte development. On the first research, after BCB staining and after IVM, several tests were performed to evaluate the effects of their potential toxicity on mitochondrial activity and functionality: reactive oxygen species (ROS), ATP, mitochondrial membrane potential and the number of copies of mitochondrial DNA. The results showed that oocytes stained with BCB produced high levels of ROS, compared with control immediately after staining and after the IVM. The ATP and mitochondrial membrane potential showed similar results between groups after staining, however, after IVM oocytes BCB showed lower membrane potential and ATP. There was no difference in the number of copies of mtDNA in the evaluated groups. Already, on test of ATP content in early embryos, ATP was lower in BCB oocytes, however, there was no difference statistical. In second study, the most commonly used media, D-PBS, was compared with a more elaborate media for BCB called here: ReproPEL. The COC s submitted to both media were submitted to nuclear and cytoplasmatic maturation, parthenogenetic activation, and to the comet test. The great rates of nuclear IVM (P<0.05) were obtained for DPBS+ (63.1%), ReproPELc (55.1%) and ReproPEL+ (50.2%). The group with smaller area of CG (P