Seleção de eventos transformados de algodão resistente a insetos por meios moleculares e de imunodetecção.

Várias instituições de ensino e pesquisa, em todo o mundo têm devotado esforços na descoberta de novas proteínas inseticidas e dos respectivos genes para o controle de pragas agrícolas. Trabalhos têm evidenciado o potencial de algumas moléculas no controle de insetos como as toxinas Bt do Bacillus thuringiensis, inibidores de proteases e de alfa-amilases e lectinas. Genes codificantes para essas proteínas têm sido estavelmente integrados ao genoma de plantas transgênicas conferindo-lhes resistência a pragas, como é o caso das culturas de tabaco, tomate, batata, milho e algodão Bt com resistência a lepidópteros que já são amplamente comercializadas em vários países. Vários estudos comprovam a economia e o benefício ecológico dessas cultivares no agronegócio internacional. Na lavoura algodoeira as pragas das ordens lepidóptera e coleóptera são os principais problemas econômicos em nível mundial. A Embrapa desenvolve pesquisas voltadas para o controle de pragas do algodoeiro com o intuito de reduzir os custos de produção, destes, 20 a 30% são para controle das pragas. Apesar dos importantes resultados obtidos até o momento o controle químico ainda tem sido o de melhor resposta embora mais oneroso no aspecto financeiro e mais agressivo no aspecto ambiental. O gene cry1Ia derivado da estirpe de Bacillus thuringiensis S1451 pode ser responsável por este tipo de controle. A atividade inseticida deste gene foi testada visando a análise da proteína recombinante para o bicudo do algodoeiro (Anthonomus grandis) e para a lagarta Spodoptera frugiperda. Indicando que este gene é bastante promissor para uso na área molecular visando obtenção de cultivar transgênica de algodão resistente a estas duas importantes pragas. Em um trabalho anterior esse gene foi inserido em três cultivares comerciais de algodão pela técnica de microinjeção via ovary drip. Nesse momento as cultivares receberam duas diferentes construções, compostas por um cassete linear mínimo mlc (≈ 3 Kb) e uma construção circular completa ccc (≈ 15 Kb), ambas contendo o gene cry1Ia. A integração do gene e expressão de proteína foram analisadas por PCR de DNA genômico, RT-PCR semi-quantitativo, Southern blot e ELISA. Mais de 1.800 transgenes foram testados e a integração do gene completo (1 cópia) foi detectada pelo ensaio de Southern blot e encontrada em apenas um único evento denominado T0 34 que foi derivado da cultivar BRS 293 no tratamento mlc, sugerindo uma tendência genótipo-dependente. A expressão da proteína Cry1Ia no evento T0 34, estimada por ELISA, foi semelhante a Bollgard comercial (Monsanto, EUA). A transmissão do transgene para progênies T1 foi demonstrada por análise de PCR e nenhum efeito pleiotrópico foi verificado nessas plantas que foram fenotipicamente normais, com flores férteis e produção de sementes abundantes. No aspecto entomológico larvas da lagarta militar foram utilizadas em bioensaios de alimentação com folhas dos eventos T0 resultantes da BRS 293. Essas mesmas plantas também foram analisadas quanto a expressão da proteína Cry1Ia, via ELISA. De um total de 48 plantas, apenas a T0 34 foi selecionada em ambos os ensaios, com taxa de mortalidade de 89% e elevada concentração da proteína toxica nas folhas. Botões florais desidratados dessa planta foram fornecidos a larvas do bicudo do algodoeiro para estudo de imunodetecção via microscopia ótica, utilizando-se tecidos do intestino médio do inseto. Verificou-se que a proteína presente nos botões florais se ligaram especificamente ao anticorpo utilizado demonstrando que esse evento é muito promissor para posteriores estudos de melhoramento visando resistência a duas importantes pragas da lavoura algodoeira.Various educational institutions and research throughout the world have devoted efforts in the discovery of new insecticidal proteins and their genes for the control of agricultural pests. Studies have shown the potential of some molecules in insect control as the Bacillus thuringiensis Bt toxins, protease inhibitors and alpha-amylase and lectins. Genes coding for these proteins have been stably integrated into the genome of transgenic plants giving them resistance to pests, such as cultures of tobacco, tomato, potato, corn and cotton with Bt resistance to lepidopteran which are widely marketed in various countries. Several studies have confirmed the economy and the ecological benefit of these cultivars in international agribusiness. In cotton field lepidopteran and coleoptera orders are the worldwide major economic problems. Embrapa develops research for the control of cotton pests in order to reduce production costs, of these, 20-30% are for pest control. Despite the important results obtained so far chemical control has still been the best answer although more costly in financial and more aggressive aspect in environmental aspect. The cry1Ia gene derived from Bacillus thuringiensis strain S1451 may be responsible for this type of control. Insecticidal activity of this gene was tested aiming at the analysis of the recombinant protein for the boll weevil (Anthonomus grandis) and Spodoptera frugiperda caterpillar. Indicating that this gene is very promising for use in molecular area aimed at obtaining cultivate transgenic cotton resistant to these two important pests. In previous work this gene was inserted into three commercial cotton cultivars by microinjection technique via ovary drip. At that moment the cultivars received two different buildings, composed of a minimum linear cassette mlc (≈ 3 Kb) and a circular complete construction ccc (≈ 15 Kb), both containing the gene cry1Ia. The integration of the gene and protein expression was analyzed by PCR of genomic DNA, semi-quantitative RT-PCR, Southern blot and ELISA. Over 1,800 transgenes were tested and the full integration of (1 copy) gene was detected by Southern blot assay and found in only a single event called T0 34 which was derived from the cultivar BRS 293 in mlc treatment, suggesting a genotype-dependent trend. The expression of Cry1Ia protein in T0 34, estimated by ELISA was similar to the commercial event Bollgard (Monsanto, USA). The transmission of the transgene to T1 progeny was demonstrated by PCR analysis and no pleiotropic effects were observed in these plants were phenotypically normal, fertile flowers and with abundant production of seeds. In entomological aspect of military caterpillar larvae were used in feeding bioassays with leaves of T0 events resulting from BRS 293. These same plants were also analyzed for expression of Cry1Ia protein via ELISA. A total of 48 plants were only T0 34 selected in both tests, the mortality rate of 89% and a high concentration of the toxic protein in the leaves. Dried flower buds of this plant were provided to larvae of the boll weevil to study immunodetection via optical microscopy, using midgut tissues of the insect. It was found that this protein in flower buds specifically bound to the antibody used to demonstrate that this event is very promising for further studies of improvement of resistance to two important pest of the cotton crop