Caracterização microbiológica, físico-química, proteômica e bioativa de queijos de coalho artesanal produzidos na Região Agreste do Estado de Pernambuco-Brasil.

O queijo de Coalho Artesanal é um produto tipicamente Nordestino e muito popular, amplamente consumido pela população local, sendo sua produção uma importante atividade no âmbito socioeconômico da Região. O objetivo deste trabalho foi estudar as características microbiológica, físico-química, proteômica e bioativa de queijos de Coalho Artesanais produzidos na Região Agreste do Estado de Pernambuco-Brasil. Os leites utilizados como matéria prima e os queijos foram obtidos em queijarias localizadas em 6 municípios da Região Agreste: Arcoverde, Cachoeirinha, Capoeiras, Correntes, São Bento do Una e Venturosa. As amostras de leite foram analisadas quanto à contagem de células somáticas (CCS) por citometria de fluxo no Somacount300, e quanto aos parâmetros físico-químicos (sólidos totais, proteínas totais, gordura total e Lactose) por leitura de absorção infravermelha no equipamento Bentley2000. Os queijos foram avaliados em relação aos parâmetros físico-químicos (proteínas, lipídeos, umidade e Lactose) de acordo com a Instrução Normativa n 68 de 12/12/2006 MAPA e microbiológicos: coliformes totais [AOAC/2002 (991.14)] e coliformes termotolerantes [AOAC/2002 (986.33)]. A microbiana láctica foi analisada através da reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando primers espécies-específicos para o gênero Lactobacilos e as espécies: Lactococcus lactis, Streptococcus thermophilus, Enterococcus faecalis e Enterococcus faecium. Os perfis proteicos dos extratos aquosos dos queijos foram analisados utilizando eletroforese SDS-PAGE e os peptídicos usando espectrometria de massa (MALDI-ToF). Os peptídeos solúveis em água (WSP) dos queijos foram testados quanto às atividades: antioxidante (método do ABTS), carreadora de zinco (método AOAC, 2000) e antimicrobiana (método NCCLS, 2003). Os resultados obtidos para os parâmetros físico-químicos e CCS dos leites estavam dentro dos padrões estabelecidos pela legislação brasileira, apresentando os seguintes valores: proteínas (2,99 - 3,48%); gorduras (3,24 - 4,0%); extrato seco total (EST) (10,79 - 12,49%); lactose (4,26 - 4,61%) e CCS (9,2 x 104 - 5,28 x 105 células/mL). Os queijos também apresentaram parâmetros físicoquímicos e microbiológicos dentro dos padrões estabelecidos pela legislação, tais como: umidade (52,76 - 58,37%); proteína (17,04 - 21,59%); lipídeos (21,25- 27%) e lactose (3,54 - 5,01%). Foi observado também que o queijo de coalho pode ser classificado como de alta a muito alta umidade e magro a semi-gordo. Todas as amostras de queijo analisadas apresentaram coliformes totais e termotolerantes dentro dos padrões de qualidade sanitária exigida para consumo humano. Os perfis das microbianas ácido-láticas dos queijos avaliados foram heterogêneos, constituídos por todos os gêneros testados (lactobacilos, lactococos, estreptococos e enterococos) e pelas espécies (Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Streptococcus thermophilus e Lactococcus lactis). Em relação ao perfil proteico, foi possível detectar a presença de lactoferrina, -lactoglobulina, - lactoglobulina, soroalbumina, -caseína, -caseína, -caseína e para--caseína, além de 12 proteínas que migraram diferente dos padrões utilizados. Quanto aos perfis peptídicos dos extratos, observou-se elevado grau de proteólise originando uma média de 66 peptídeos dentre os quais 32 identificados na literatura como produtos da hidrólise das caseínas (11 S1-Casein, 3 S2-Casein, 15 -caseína e 3 -caseína) e 7 caseinofosfospeptídeos. Dentre os peptídeos não identificados, três apresentaram picos de alta intensidade com pesos moleculares de 1597, 1725/1726,37 2778/2779 Da, sugerindo que estes podem ser um possível marcador molecular para os queijos de coalho do agreste de Pernambuco. Os extratos aquosos dos queijos de Coalho apresentaram as seguintes bioatividades: antioxidante (91,1 0,43 - 75,92 0,7% de inibição); carreadora de zinco (75,47 0,5 - 61,67 0,65 % de carreamento) e antimicrobiana para as bactérias Enterococcus faecalis, Bacillus subtilis, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa. Enfim, este trabalho mostra o grande potencial biotecnológico que confere alto valor agregado ao queijo de coalho regional contribuindo para o desenvolvimento do setor produtivo do Estado de Pernambuco.The Artisanal Coalho cheese is a product typically northeastern and very popular, widely consumed by local population, representing an important socioeconomic activity for this region. The aim of this study was to obtain the microbiological, physicochemical, proteomics and bioactive characterizations of the Artisanal Coalho cheeses produced in the Agreste region of Pernambuco State - Brazil. The milks used as raw material in the manufacture of cheese and the cheeses were obtained from factures located in six Towns: Arcoverde, Cachoeirinha, Capoeiras, Correntes, São Bento do Una and Venturosa. The milk samples were analyzed for somatic cell counts (CCS) by flow cytometry in Somacount300, physico-chemical parameters (total solids, total protein, total fat and lactose) by absorbance from infrared absorption equipment Bentley2000. The cheeses were evaluated about physico-chemical parameters (proteins, lipids, moisture and lactose) according to Instruction n68 of 12/12/2006 - MAPA, microbiological testing for the presence of total [AOAC/2002 (991.14)] and termotolerants [AOAC/2002 (986.33)] coliforms. Lactic microbiota was analyzed by polymerase chain reaction (PCR) using species-specific primers in spite of Lactobacillus genus, and the following: species Lactococcus lactis, Streptococcus thermophilus, Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium. The profiles of proteins of the aqueous extracts from cheeses were analyzed by SDS-PAGE electrophoresis and peptides by mass spectrometry (MALDI-ToF). Water-soluble peptides (WSP) from Coalho cheeses were tested for following activities: antioxidant (ABTS method); zinc-biding (AOAC method, 2000) and antimicrobial (NCCLS method, 2003). The results obtained for the physico-chemical and CCS parameters of milks used as raw material were within the limits established by Brazilian law, showing these results: proteins (2.99 3.48%); fats (3.24 4.0%); total dried extract (10.79 12.49%); lactose (4.26 4.61%) and CCS (9.2 x 104 5.28 x 105 cells/mL). The cheeses also had values for the physico-chemical and microbiological parameters within the standards established by law, such as: moisture (52.76 58.37%); proteins (17.04 21.59%); fats (21.25- 27%) and lactose (3.54 5.01%). It was observed that the coalho cheeses can be classified as high to very high moisture and non-fat to semi-fat cheese. All the cheese samples had total and thermotolerant coliforms according to the sanitarian standards of quality necessary for human consumers. The profile of lactic microbiota of cheeses evaluated showed heterogeneous comprising all genus (lactobacillus, lactococcus, estreptococcus e enterococcus) and e species (Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Streptococcus thermophilus e Lactococcus lactis) tested. In spite of the proteic profile using aqueous extracts, it was possible to detect the presence of lactoferrin, lactoglobulin, lactoglobulin, serum albumin, casein, casein, casein and para casein and more 12 different proteins compared to the protein standard. The peptide profiles of the WSP samples showed high degree of proteolysis resulting in an average of 66 peptides containing 32 known peptides by literature obtained as product from casein hydrolysis (11 S1-Casein, 3 S2-Casein, 15 -casein and 3 -casein) and 7 caseinphosphopeptides. Among non-identified peptides, three of them showed peak at high intensity in all Coalho cheeses studied, with a molecular weight of 1597, 1725/1726, 2778/2779 Da, suggesting that these peptides may be a possible molecular marker for the Coalho cheese of Agreste Pernambuco State-Brazil. Regarding to bioactivities using WSP samples, the results showed the following activities: antioxidant (91.1 0.43 -75.92 0.7% inhibition); zinc-binding (75.47 0.5 - 61.67 0.65% of bind) and antimicrobial for bacteria Enterococcus faecalis, Bacillus subtilis, Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa. Finally, this work showed the great biotechnological potential of this cheese that lead to the high aggregation value for regional Coalho cheeses collaborating to socioeconomic development of the productive sector in the Pernambuco State