Implicancias farmacéuticas de la conjugación de péptidos a nanopartículas de oro : efectos sobre la interacción con proteínas plasmáticas, la estabilidad, la toxicidad y la biodistribución

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Doctor en Ciencias FarmacéuticasAl exponer diferentes Nanomateriales (NM) al plasma sanguíneo estos son reconocidos por biomoléculas, formándose una nano-bio interface denominada corona de proteínas (CP), en la que se observan interacciones dinámicas debido a que los ambientes biológicos son transitorios y no homogéneos. Dichas interacciones pueden ser claves en la modulación de la biodistribución, eliminación, de las respuestas inmunes y de la metabolización de los NM. En este contexto se propone que la naturaleza de los NM influirán sobre las interacciones inespecíficas con los componentes biológicos, esperándose a futuro poder regular dichas interacciones según los intereses farmacéuticos. En este proyecto de tesis se han obtenido conjugados de nanopartículas metálicas de oro (NpO) con péptidos como CLPFFD formando el conjugado NpO-CLPFFD, utilizados para destruir agregados proteicos amiloides (Aβ) involucrados en la Enfermedad de Alzheimer (EA) mediante la aplicación de radiación electromagnética. Dado que in vivo el conjugado NpO-CLPFFD llega en una muy baja proporción al cerebro respecto de la dosis inyectada (DI) se incorporó la secuencia peptídica THRPPMWSPVWP (THR), reconocida por el receptor de transferrina presente en la Barrera Hematoencefálica (BHE) con el fin de favorecer la transcitosis y el ingreso al sistema nervioso central. Es importante mencionar que una característica común de los conjugados es su gran acumulación en hígado y bazo, afectando así la llegada al cerebro. Esta elevada acumulación así como la penetración a través de la BHE esta relacionada con la formación de la CP que se forma al ponerse en contacto las nanopartículas con el plasma. Por lo cual, en este trabajo se realizó una caracterización de la CP con el fin de comprender su posible influencia sobre el comportamiento farmacocinético de las NpO. Es así que se evaluó como la CP formada sobre los conjugados NpO péptidos puede modificarse tras incorporar secuencias peptídicas como THRPPMWSPVWP, CALNN o Cpeg a CLPFFD En el desarrollo de esta tesis nanoesferas de oro (NE) se conjugaron con los péptidos CLPFFD, CALNNLPFFD, C-PEG-LPFFD, CALNN, C-PEG y THRPPMWSPVWPCLPFF (THRCLPFFD) y Nanovarillas de oro (NV) se conjugaron con CLPFFD. Los conjugados se caracterizaron por Espectroscopia UV-Vis, TEM, DLS, XPS y AAA y luego se emplearon para realizar estudios in vitro e in vivo. Posteriormente, los conjugados fueron incubados in vitro con plasma humano, evaluándose la estabilidad de los coloides por UV-Vis y el crecimiento del tamaño de las NpO por DLS debido a la presencia de la CP. Las proteínas de la CP fueron separadas e identificadas por geles SDS-Page, geles bidimensionales y por LC/MS/MS encontrando parámetros de comparación entre los conjugados. Las NpO conjugadas con los péptidos estudiados son especies coloidales estables en el tiempo y la presencia de la CP produce un aumento del diámetro hidrodinámico que conlleva a estabilización estérica. Las proteínas que conforman la CP tienen relación directa con el destino de las mismas en el organismo. Así proteínas detectadas estarían asociadas al reconocimiento por el sistema fagocitico mononuclear (SFM), la acumulación en hígado y bazo, como son las proteínas Ig, CO3, CO4, entre otras. Otras proteínas como la ApoE y la albúmina actuarían favoreciendo el pasaje a través de la BHE tal como sucede con NE-THRCLPFFD y en menor proporción con NE-CLPFFD. En base a lo encontrado se recubrieron NE-CLPFFD y NE-THRCLPFFD con ApoE, para luego realizar estudios in vivo, observándose que existe un aumento en la llegada al cerebro. Esto indica la importancia de la naturaleza de las proteínas de la CP sobre la distribución de las NpO así como también la posibilidad de poder modular la misma para un eventual tratamiento basado en NpOBy exposing different Nanomaterials (NM) with plasma, they are recognized by biomolecules conforming a nano-bio-interface called protein corona (CP), showing dynamics interactions because the biological environment is transient and not homogenous. These interactions could be the key in the modulation of the biodistribution, elimination, immune response and metabolization of NM. Suggesting that the features of NM has influence on non-specific interactions with biological components, It is expected in the future that they can such interactions be regulated according the pharmaceutical approach. In this thesis were obtained conjugates of gold nanoparticles (NpO) with peptides as CLPFFD (NpO-CLPFFD). This last sequence can recognize protein aggregates of β- amyloid involved in Alzheimer’s disease. Since in vivo the conjugates reach the brain in very low proportion, it was proposed to incorporate the peptide sequence THRPPMWSPVWP (THR), a sequence recognized by the transferrin receptors in endothelial cells of the blood brain barrier (BHE) promoting transcytosis of nanoparticles. However, we observed that all conjugates were accumulated in liver and spleen, interfering with arriving to brain. Therefore, the study for the interactions of NpO with the proteins conforming the CP helps us to understand and explain the pharmacokinetic behavior all them. In this work nanospheres (NE) were conjugated with the peptides CLPFFD, CALNNLPFFD, CpegLPFFD, CALNN, Cpeg and THRPPMWSPVWPCLPFFD (THRCLPFFD) and NpO as nanorods (NV) were conjugated with CLPFFD. Each conjugate obtained was characterized by UV-Vis spectroscopy, TEM, DLS, XPS and AAA. Then the conjugates were used to studies in vitro e in vivo. Next these conjugates were incubated in vitro with human plasma, to evaluate the stability by UV-Vis, the size effect by DLS and by TEM. Finally, the proteins of the CP were separated and identified by electrophoresis SDS-PAGE and 2D, and by LC-MS/MS to find comparative parameters between conjugates. The results obtained show that these conjugates are stable colloidal species in the time and the CP affects the diameter of the nanoparticles. A set of proteins found in the CP could determine the destiny of this NpO to will take in the organism. Thus proteins detected (as are the proteins Ig, CO3, CO4 and other) are associated with the recognition by the mononuclear phagocytic system (SFM) and their accumulation in liver and spleen. On the other proteins as ApoE or albumin that were detected in the CP of NE-THRCLPFFD and NE-CLPFFD favor the passage through the blood brain barrier. Finally, due to these results, to corroborate the approach from the ability to modify the CP, we incubated NE-CLPFFD and NE-THRCLPFFD with ApoE, then these conjugates were used in vivo, observing an enhancement in the penetration into the brain. This indicates the importance of CP on distribution of NpO as well as the possibility of modulating it to a possible drug treatment based on NpO addressed to the central nervous systemFONDECYT CONICY