Aplicación del análisis del control metabólico al estudio de la regulación de la síntesis de glicógeno in vivo en oocitos de Caudiverbera caudiverbera (Linneaus) : coeficiente de control para UDP-glucosa pirofosforilasa y glicógeno sintasa en la vía de síntesis de glicógeno

Memoria para optar al título profesional de BioquímicoTradicionalmente se ha abordado el estudio del control del metabolismo analizando las propiedades de los componentes de un sistema (enzimas, transportadores y otros) aislados del sistema completo. Durante las dos últimas décadas se han desarrollado algunas teorías para analizar el comportamiento de sistemas metabólicos completos con una aproximación sistémica, entre ellas la llamada análisis del control metabólico. Esta teoría considera los sistemas metabólicos como un todo; así, la respuesta del flujo original (δJ) a un pequeño cambio en la actividad de una enzima (δe) será entonces consecuencia de todas las variaciones de las concentraciones de intermediarios. Esta respuesta puede ser cuantificada por el coeficiente de control del flujo. En este trabajo se intentó determinar qué grado de control ejercen en la regulación del flujo de la vía directa de síntesis de glicógeno las enzimas UDP-glucosa pirofosforilasa (UGPasa) y glicógeno sintasa (GS), usando como modelo experimental los oocitos en estadio VI de rana Caudiverbera caudiverbera. UGPasa cataliza la reacción UTP + glucosa-1-P ⇔ UDP-glucosa + PPi. Ésta es una reacción que se encuentra en todos los organismos hasta ahora estudiados. Además de su función clave en la síntesis de disacáridos y polisacáridos, la enzima es esencial en la síntesis de la parte carbohidrato de glicolípidos, glicoproteínas y una variedad de metabolitos secundarios. La actividad de UGPasa en extractos crudos de oocitos de C. caudiverbera se midió en el sentido de la formación de UDP-glucosa por electroforesis capilar. Las corridas se realizaron en un capilar no protegido de 57 cm de longitud y 50 μm de diámetro, a un voltaje de 22 kV. La señal del nucleótido se determinó a 254 nm. Cuando se aplicó el método para medir la actividad de la enzima en extractos crudos se obtuvo una curva de tiempo lineal durante un tiempo experimental apropiado. La reacción reversa se midió por el método espectrofotométrico, acoplando y cuantificando la formación de NADPH a 340 nm. La actividad endógena de la enzima en oocitos resultó ser alrededor de 12 mU/oocito. La enzima presenta actividad máxima a pH 8,5. En relación a las constantes cinéticas para los sustratos de la reacción reversa, se encontró que la enzima tiene cinética sigmoidea para pirofosfato, con un K0,5 de alrededor de 460 μM y un nH mayor que 2,0. La cinética para UDP-glucosa es hiperbólica, con una Kmapp de 50 μM. Para la determinación del coeficiente de control de la enzima se procedió a inyectar en los oocitos cantidades crecientes de UGPasa pura. Se usó la enzima comercial de Sigma. Dado que ésta contenía impurezas, se procedió a purificarla por medio de una columna de exclusión molecular. La enzima microinyectada en los oocitos permaneció activa durante el tiempo que duraban los experimentos. El coeficiente de control para la enzima UGPasa en la vía directa de síntesis de glicógeno fué 0,15 y en la vía indirecta, 0,05. La glicógeno sintasa ha sido considerada tradicionalmente la enzima reguladora de la síntesis de glicógeno, pero estudios in vivo han puesto en duda esta afirmación. No existe enzima comercial disponible y no fue posible obtener enzima pura en la concentración adecuada para la microinyección. Como alternativa se procedió a la activación de la enzima por medio de glucosa-6- P. Los experimentos para determinar el efecto de la glucosa-6-P sobre la GS se realizaron microinyectando diferentes concentraciones de glucosa-6-P. Después de 8 min se procedió a la microinyección de UDP-[U-3H]glucosa 3 mM. Después de 12 min de incubación, se midió la radiactividad en glicógeno. La activación máxima de la enzima fue entre 2 y 3 veces a 2 mM de glucosa-6-P inyectada. El efecto del éster fue transitorio, siendo máximo entre 5 a 10 min. Para la determinación del coeficiente de control se microinyectaeon diferentes concentraciones de glucosa- 6-P. Después de 8 min de incubación los oocitos recibieron [U-14C]glucosa (6 nmoles). Después de 12 min incubación, se midió la radiactividad en glicógeno. El coeficiente de control para GS en la vía directa de síntesis de glicógeno fue igual a 0,01. Los coeficientes de control de las otras enzimas de la vía han sido previamente determinados en el laboratorio. Para hexoquinasa resultó ser de 0,6 y para fosfoglucomutasa de 0,2. Según el teorema de la suma, la suma de los coeficientes de control de todas las enzimas en una vía metabólica es igual a 1. Para el caso de la síntesis de glicógeno, la suma de los coeficientes de control de las enzimas en la vía directa en oocitos de anfibio fue 0,96. Esta es la primera vez que se determinan todos los coeficientes de control de una vía metabólica completa en un sistema in vivo.Traditionally metabolic control and regulation has been studied by analysing the properties of the system components (enzymes, transporters and others) isolated from the whole system. During the last two decades, new proposals have emerged to analyze the behaviour of complete metabolic systems with a systemic approximation. Among them is the so called Metabolic Control Analysis. This approach considers the metabolic system as a whole; thus, the response of the original flux (δJ) to a small change in the activity of one enzyme (δe) will be then the consequence of all the variations of the intermediate concentrations. This response may be quantified by the flux control coefficient. The aim of this work was to determine the involvement of the enzymes UPD-glucose pyrophosphorylase (UGPase) and glycogen synthase (GS) on the control of the flux through the direct path way for glycogen synthesis. Oocytes stage VI from C. caudiverbera were used as an in vivo experimental model. UGPase catalyzes the reaction UTP + glucose-1-phosphate ⇔ UDP-glucose + PPi. This is a reaction found in all the organisms so far studied. Besides its key function in the synthesis of disccharides and polysaccharides, the enzyme is essential in the synthesis of the carbohydrate part of glycolipids, glycoproteins and a variety of secondary metabolites. The activity of UGPase in crude extracts from C. caudiverbera oocytes was measured in the forward formation of UDP-glucose by capillary electrophoresis. Separations were performed in a non protected capillary of 57 cm long and 50 μm diameter, at a voltage of 22 kV. The signal of the nucleotide was determined at 254 nm. When the method was applied to measure the enzyme activity in crude extracts, a linear time curve was obtained during an appropiate experimental time. The reverse reaction was measured by the spectrophotometric method, coupling and quantitating the formation of NADPH at 340 nm. The endogenous activity of the enzyme in oocytes was about 12 mU/oocyte. The enzyme presents maximum activity at pH 8,5. In relation to the kinetic constants for the substrates of the reverse reaction, it was found that the enzyme has sigmoidal kinetics for pyrophosphate, with a K0,5 of about 460 μM and a nH higher than 2.0. The kinetic for UDP-glucose is hyperbolic, with a Kmapp of 50 μM. To determine the control coefficient of the enzyme, increasing quantities of pure commercial UGPase, were microinjected into the oocytes. Because the enzyme was not homogenous, it was purified by molecular exclusion. The microinjected enzyme inside the oocytes remained active during the time of the experiments. The control coefficient for UGPase in the direct path way for glycogen synthesis was 0.15 and 0,05 in the indirect way. Glycogen synthase has been traditionally considered the regulatory enzyme of glycogen synthesis, but studies in vivo have questioned this statement. There is no commercial enzyme available and it was not possible to obtain pure enzyme in the proper concentration for microinjection in our laboratory. As an alternative, activation of the enzyme by glucose-6-P was chosen. The experiments to determine the effect of glucose-6-P on GS were carried out by microinjecting into the oocytes different concentrations of glucose-6-P. After 8 min, microinjection of 3 mM UDP- [U-3H]glucose was performed. After 12 min incubation, the radioactivity on glycogen was measured. The maximum activation of the enzyme was between 2-3 times at 2 mM glucose-6-P. The effect of the ester was temporary, being maximum between 5 to 10 min. To determine the control coefficient into the cells, different concentrations of glucose-6-P were microinjected . After 12 minutes incubation, the radioactivity in glycogen was measured. The control coefficient for GS in the direct pathway for synthesis glycogen was 0.01. The control coefficient of the other enzymes of the pathway have been previously determined in the laboratory. For hexokinase it was 0.6 and for phosphoglucomutase, 0.2. According to the summation theorem, the sum of the control coefficients of all the enzymes involved in a metabolic path is equal to 1. In the case of glycogen synthesis pathway, the sum of the control coefficients of the enzymes in the direct route in amphibian oocytes was 0.96. This is the first time that all control coefficients for a complete metabolic pathway are determined in a system under in vivo conditions