Influence des facteurs neurotrophiques et des fibres nerveuses dans la peau reconstruite par génie tissulaire

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2013-2014.La peau est un organe densément innervé et vascularisé. L’établissement du réseau nerveux dépend de la sécrétion de signaux diffusibles dans la peau qui instruisent à distance certains neurones de s’y arboriser. Ces signaux sont les facteurs neurotrophiques. L’établissement du réseau vasculaire dépend aussi de la présence de signaux instructifs. Notre objectif général était de mieux comprendre l’influence des signaux neurotrophiques et aussi nerveux dans le contexte cutané. Les travaux présentés dans cette thèse décrivent de nouvelles interactions paracrines. Alors que certaines de ces interactions depuis la peau vers les neurones sensoriels et certaines depuis les neurones sensoriels vers le réseau vasculaire pour la vasodilatation sont déjà établies, nous décrivons l’influence des facteurs neurotrophiques sur le réseau vasculaire et l’influence des neurones sensoriels sur la réépithélialisation. Nous avons premièrement émis l’hypothèse qu’en plus d’influencer les neurones, les facteurs neurotrophiques influencent le réseau vasculaire. Nous montrons que le NGF, le BDNF, le NT-3 et le GDNF sont tous exprimés dans l'épiderme, que le NGF et le NT-3 sont exprimés par les fibroblastes et que le BDNF est produit par les cellules endothéliales. Les cellules de Schwann, également retrouvées dans la peau, produisent du NGF, BDNF et GDNF. Nous montrons que ces peptides sont de très puissants facteurs angiogéniques en utilisant un modèle de derme endothélialisé humain reconstruit par génie tissulaire. Une augmentation de 40 à 80 % du nombre de pseudocapillaires fut observée après l'addition de 10 ng/ml de NGF, 0,1 ng/ml de BDNF, 15 ng/ml de NT-3, et 50 ng/ml de GDNF. Cet effet angiogénique dépend de la liaison aux récepteurs de facteurs neurotrophiques TrkA, TrkB, GFRa-1 et c-ret, qui sont tous exprimés par les cellules endothéliales humaines. Cet effet a été bloqué pour les récepteurs Trk par l’addition de l'inhibiteur compétitif K252a. Ensuite, nous avons dans un deuxième temps émis l’hypothèse que les neurones sensoriels influencent directement la réépithélialisation. Pour vérifier cela, nous avons développé un nouveau modèle de réépithélialisation par génie tissulaire. Il est constitué d’un équivalent épidermique troué exprimant une protéine fluorescente verte qui a été empilé sur un équivalent dermique servant de substrat pour l’épiderme qui referme alors naturellement la plaie. L’équivalent est endothélialisé et innervé ou non par les neurones sensoriels de souris. Nous avons observé que la réépithélialisation est plus rapide en présence de neurones sensoriels. Nous avons démontré que les neurones sensoriels sécrètent une petite protéine dans notre modèle, soit de la substance P, et que les kératinocytes expriment le récepteur cellulaire NK1 de la substance P. Enfin, nous montrons que la substance P contribue à augmenter la vitesse de fermeture des plaies induites par les neurones à l'aide d’un agoniste et d’un antagoniste du récepteur NK1. L'ensemble des résultats procure une meilleure compréhension de l’importance des contextes neurotrophiques et nerveux dans la peau. Nos résultats pourraient laisser présager que d’améliorer la régénération nerveuse cutanée lorsqu’elle est déficiente améliorerait aussi l’homéostasie du tissu cutané.The skin is an organ densely innervated and vascularized. The establishment of the cutaneous nervous system depends on the secretion of neurotrophic factors by the skin. Meanwhile, the establishment of the vascular network also depends on soluble instructive cues. The work presented in this thesis describes new paracrine interactions. While interactions from skin to sensory neurons for the development of innervation and interactions from sensory neurons to blood vessel for vasodilation of the vasculature are described elsewhere, we demonstrate here the influence of neurotrophic factors on the vascular network and the influence of sensory neurons on the reepithelialization of wounds. Our overall goal was to clarify the influence of the neurotrophic and nervous contexts on the homeostasis of the skin. First, we hypothesized that in addition to their neuronal contribution, neurotrophic factors also influence the vascular network. We show that NGF, BDNF, NT-3 and GDNF are expressed in the epidermis, while NGF and NT-3 are expressed by fibroblasts and BDNF by endothelial cells. Finally, Schwann cells produce NGF, BDNF and GDNF. We show that these peptides are very potent angiogenic factors using a model of human endothelialized reconstructed dermis by tissue engineering. An increase of 40 to 80% of the number of capillary-like tubes was observed after the addition of 10 ng/ml NGF, 0.1 ng/ml of BDNF, 15 ng/ml of NT-3, and 50 ng/ml of GDNF. This angiogenic effect depends on the neurotrophic factor receptor TrkA, TrkB, GFRa-1 and c-ret that are all expressed by human endothelial cells. This effect was blocked by adding the Trk inhibitor K252a for NGF, BDNF and NT-3. Second, we hypothesized that sensory neurons directly influence reepithelialization by secreting the neuropeptide substance P. To verify this, we developed a new model of reepithelialization. It consists of a perforated epidermal equivalent expressing a green fluorescent protein stacked on a dermal equivalent that is used as a bed for reepithelialization. The reconstructed skin is endothelialized and innervated or not with sensory neurons of mouse. Sensory neurons produce substance P in the model and keratinocytes express the NK1 cell receptor for substance P. Keratinocyte migration was quantified by fluorescence. Reepithelialization was faster in presence of sensory neurons and we show that substance P contributes to this effect with agonist and antagonist of the NK1 cell receptor. The overall results provide a better understanding of the importance of the neurotrophic and sensory contexts in the skin. Thus, cutaneous innervation does not only contribute to the sensory detection. Our findings may suggest that improving nerve regeneration would improve skin long term tissue homeostasis