Utilisation d'axicons pour la microscopie à deux photons

Un des enjeux majeurs de la biochimie et de la biologie cellulaire actuelle est de pouvoir suivre de manière dynamique les événements moléculaires à l'intérieur de la cellule vivante dans son contexte fonctionnel, c'est-à-dire in situ (dans son tissu d'origine). Il ne suffit plus, par exemple, d'identifier une réaction biochimique in vitro pour pouvoir savoir si un enzyme ou un autre rencontrera son substrat à l'intérieur de la cellule. Il apparaît de plus en plus évident que des facteurs spatio-temporels très fins à l'intérieur de la cellule vivante déterminent en grande partie la spécificité des signaux cellulaires. Il suffit de penser aux fluctuations calciques intracellulaires, par exemple, qui participent à une multitude de cascades de signalisation; sans spécificité spatiale et temporelle, la cellule ne pourrait utiliser les signaux calciques de manière utile et efficace. A cette fin, on propose un système de microscopie laser qui incorpore un axicon, lequel a la propriété de focaliser la lumière en un faisceau quasi-Bessel. Le contrôle du profil du faisceau incident sur l'axicon procure une ligne focale sur l'axe longitudinal ayant une intensité constante dans le milieu absorbant ainsi qu'une grande résolution transverse. Conséquemment, nous devons balayer notre échantillon en deux dimensions seulement pour obtenir une image complète de tout le volume, réduisant ainsi considérablement le temps d'acquisition. Nous présenterons les résultats théoriques de la génération d'un faisceau quasi-Bessel dans un échantillon absorbant, les caractéristiques du laser Ti:saphir utilisé ainsi que le schéma proposé pour la microscopie laser avec un axicon. Nous verrons qu'il est possible d'imager des échantillons fluorescents allant jusqu'à 1 mm d'épaisseur avec un seul balayage. Dans cette thèse, nous passerons en revue quelques principes qui sont à la base des avantages de la microscopie par excitation à deux photons afin de mettre en relief certains des défis (résolution spatiale, résolution temporelle, sensibilité, profondeur de pénétration dans le tissu et phototoxicité) pour améliorer l'utilisation de cette approche pour l'imagerie cellulaire fonctionnelle. Les propriétés des faisceaux de Bessel formés par l'axicon seront étudiées en profondeur. Nous décrirons ensuite notre microscope à deux photons avec un axicon et nous présenterons plusieurs résultats obtenus avec ce dernier