Développement et utilisation d'une plateforme d'imagerie optique quantitative, multimodale et non linéaire de la moelle épinière chez les animaux vivants

La microscopie optique chez les animaux vivants est un outil de recherche prometteur pour l’avancement de la neurobiologie. L’imagerie intravitale offre un aperçu en direct de la réponse des cellules individuelles aux dommages affectant le système nerveux. Combinée à la vaste gamme de souris transgéniques disponibles commercialement et compatibles avec différents modèles animaux de maladies neurodégénératives, la microscopie in vivo favorise la compréhension du déroulement des pathologies et du fonctionnement des thérapies. Il est capital de travailler à l’émergence de cet outil, qui se présente comme une stratégie dotée d’un énorme potentiel. Le projet de doctorat décrit dans cette thèse porte donc sur le développement et l’utilisation d’une plateforme de microscopie quantitative, multimodale et non linéaire pour l’imagerie de la moelle épinière chez les animaux vivants. Premièrement, nous avons enrayé la dépendance en polarisation de l’intensité du signal de diffusion Raman cohérente (CARS, « coherent anti-Stokes Raman scattering »), de façon à adapter les images à l’interprétation histologique. Nous avons appliqué cette technique afin d’étudier l’histologie de la myéline de la moelle épinière du rat. En second lieu, nous avons proposé une nouvelle procédure d’analyse d’images compatible avec l’imagerie d’animaux vivants, dans le but de faire de l’histologie des axones myélinisés. Nous avons alors quantifié, dans un modèle de blessure par écrasement d’un nerf, la démyélinisation proximale et la remyélinisation distale au site de lésion ex vivo et in vivo respectivement. Troisièmement, nous montrons que l’imagerie de CARS de la moelle épinière de souris vivantes peut être réalisée avec un microendoscope, et ce tout en conservant sa compatibilité avec le signal de fluorescence par excitation à deux photons. Finalement, nous discutons d’une stratégie de traitement numérique d’images pour réduire les artefacts reliés au mouvement de l’animal. Cette technique permet l’étude histologique de la myéline et la quantification de la motilité des cellules microgliales dans leur environnement natif. En définitive, cette thèse démontre que la microscopie de CARS in vivo progresse peu à peu vers un outil grand public en neurobiologie.Optical microscopy in living animals is a promising research tool for the evolution of neurobiology. Intravital imaging offers a live preview of how individual cells respond to the nervous system damages. Applying in vivo microscopy to a panoply of transgenic mice used with different animal models of neurodegenerative diseases promotes the understanding of the progress of pathologies and the comprehension of how therapies work. It is thus essential to promote the emergence of optical microscopy technologies in living animals because it is a strategy with great potential. Therefore, the project described in this doctoral thesis focuses on the development and use of a microscopy platform for quantitative, multimodal and nonlinear imaging of the spinal cord in living animals. First, we alleviated the polarization dependence of the coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) signal intensity. This strategy makes images more amenable to histological interpretation. With this technique, we studied the histology of myelin in the rat spinal cord. Secondly, we proposed a new image analysis procedure compatible with live animals imaging in order to achieve the histology of myelinated axons. We quantified the demyelination proximal, and remyelination distal to the crush site ex vivo and in vivo respectively. Third, we showed that CARS imaging of the spinal cord in living mice can be achieved with a microendoscope, and this while maintaining compatibility with the two-photon excitation fluorescence signal. Finally, we discuss a digital image processing strategy that reduces imaging artifacts related to movement of the animal. This technique allows the histological study of myelin and the quantification of the motility of microglial cells in their native environment. Ultimately, this thesis demonstrates that in vivo CARS microscopy progresses gradually towards a robust tool for research in neurobiology