Caractérisation des protéines ChuX, ChuY et ChuW de la voie d'acquisition de l'hème chez E. coli O157:H7

Les microorganismes pathogènes qui infectent l’être humain ont besoin de fer pour croître et se multiplier. Chez l’humain, la majorité du fer est séquestré dans l’hème et dans des protéines à cause de sa faible solubilité au pH physiologique en présence d’oxygène. Les bactéries pathogènes ont dû développer divers systèmes d’acquisition afin d’utiliser l’hème comme source de fer. Les protéines ChuX, ChuY et ChuW sont codées par des gènes faisant partie du regroupement de gènes chu codant pour une voie d’acquisition directe de l’hème chez la bactérie E. coli O157:H7. Peu d’attention a été portée à ces trois protéines et les fonctions prédites selon leur séquence primaire ont été investiguées. Dans ce mémoire, nos résultats révèlent que la protéine ChuY, faisant partie de la famille des réductases à courtes chaînes atypiques, réduit le tripyrrole issu de la réaction de dégradation de l’hème catalysée par ChuS en utilisant le NADPH comme cofacteur. Cette réductase accélère aussi de neuf fois la vitesse de l’étape limitante de la réaction de ChuS, soit l’ouverture du porphyrine du verdohème. Les études spectroscopiques et la détermination des constantes cinétiques pré-stationnaires ont permis de confirmer que ChuY agit de façon catalytique. Les résultats permettent aussi de proposer un modèle de dégradation de l’hème impliquant les protéines ChuS et ChuY. La protéine ChuX aurait un rôle dans le transport et le stockage de l’hème. Nos résultats ont montré que la protéine holo-ChuX transfère l’hème à la protéine apo-ChuS rapidement, et que celle-ci assure ensuite sa dégradation. Finalement, aucun essai enzymatique n’a été effectué avec la protéine ChuW à cause de son insolubilité. Dans l’ensemble, cette étude a permis d’obtenir une meilleure compréhension du rôle respectif des protéines ChuY et ChuX dans le système d’acquisition de l’hème par E. coli O157:H7.Pathogenic microorganisms that infect a mammalian host need iron to survive and grow. However, because of its low solubility at physiologic pH in aerobic environment, the majority of iron is sequestered in heme and proteins. Pathogenic bacteria have developed ways to acquire heme from the host as a source of iron. ChuX, ChuY and ChuW are proteins encoded by a gene cluster involved in direct heme acquisition in Escherichia coli O157:H7. So far, these three proteins have received little attention. In this study, the functions of these proteins have been investigated based on predictions from the primary sequence analyses. Our results reveal that the ChuY protein, belonging to the short chain dehydrogenase/reductase family, reduces the tripyrrole derived from the heme degradation reaction catalyzed by the ChuS protein using NADPH as cofactor. ChuY also accelerates nine times the rate-limiting step of the ChuS reaction, which is the opening of the porphyrin ring of verdoheme. Spectroscopic studies and the determination of the pre-stationary kinetic constants have confirmed the catalytic reductase activity of ChuY. From our results, a model of heme degradation involving both the ChuY and ChuS proteins is proposed. The ChuX protein is predicted to have a role in the transport and storage of heme. Our results show that holo-ChuX can transfer heme to the apo-ChuS protein quickly, after which heme degradation can start. Enzymatic testing of the ChuW protein could not be carried out because of the insolubility of this protein. Overall, this study has resulted in a better understanding of the respective role of the ChuY and ChuX proteins in the direct heme acquisition system of E. coli O157:H7